Neue Ansätze für eine Antikörper-basierte Therapie CD20+ lymphoider Neoplasien

Abstract

Die Behandlung lymphoider Neoplasien konnte in den letzten Jahren insbesondere durch Antikörper-basierte Therapeutika deutlich verbessert werden. Dennoch stellen Rezidive weiterhin ein schwerwiegendes Problem dar, weshalb ein großer Bedarf an innovativen Therapieoptionen besteht. Das zentrale Ziel dieser Arbeit bestand daher in der Entwicklung und funktionellen Charakterisierung neuer Antikörper-basierter Immuntherapeutika. Dabei wurden folgende Moleküle untersucht, welche auf unterschiedliche Weise wirken, die aber alle gegen das CD20-Antigen auf Lymphomzellen gerichtet sind:

• Monospezifische anti-CD20-Antikörper mit optimiertem Fc-Teil Wie die Erfolgsgeschichte des chimären monoklonalen anti-CD20-Antikörpers Rituximab zeigt, stellen derartige Antikörper einen effizienten Ansatz bei der Therapie von B-Zell-Lymphomen dar. Dabei spielt die Antikörper-vermittelte zelluläre Zytotoxizität (ADCC) eine wesentliche Rolle. Im Rahmen dieser Arbeit wurde basierend auf den Arbeiten von Lazar et al. [Lazar et al., 2006] und mit Hilfe von durch L. Große-Hovest (Abt. Immunologie, Universität Tübingen) entwickelten Expressionsvektoren ein Austausch der Aminosäuren S293 zu D293 und I332 zu E332 im Fc-Teil des anti-CD20-Antikörpers 2H7 durchgeführt. Dadurch konnte die Effizienz der Antikörper-vermittelten zellulären Zytotoxizität (ADCC) um mehrere Zehnerpotenzen gesteigert werden. Dies ist auf eine verbesserte Interaktion mit den aktivierenden Fc-Rezeptoren von Effektorzellen zurückzuführen. Auch durch einen einfachen Wechsel der Expressionszelllinie hin zu der gering-fucosylierenden Zelllinie YB2/0 konnte die ADCC-Effizienz wesentlich gesteigert werden. Durch eine Kombination der Aminosäure-Mutation und einer Expression in YB2/0-Zellen wurde jedoch keine weitere Verbesserung der ADCC-Effizienz erreicht.

• Bispezifische Antikörper zur supra-agonistischen T-Zellstimulation über CD28 Bispezifische Antikörper können so konstruiert werden, dass nur dann eine Aktivierung von Oberflächenrezeptoren auf Immunzellen möglich ist, wenn sie mit ihrem zweiten Arm gleichzeitig an das Zielantigen, in der Regel ein tumorassoziiertes Antigen, gebunden haben. Grosse-Hovest et al. gelang es 2003 erstmalig eine Zielzell-restringierte supra-agonistische CD28-Stimulation mit einem rekombinanten bispezifischen single-chain Antikörper mit Spezifität CD28 x NG2 (r28M) zu zeigen [Grosse-Hovest et al., 2003]. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte für den bispezifischen single-chain Antikörper r2820 mit Spezifität für CD28 und CD20 nachgewiesen werden, dass er die Fähigkeit zur Vermittlung einer Zielzell-restringierten supra-agonistischen T-Zellaktivierung und einer Lyse CD20-positiver Zielzellen im vollständig autologen System besitzt. Dies zeigt, dass die Zielzell-restringierte supra-agonistische CD28-Stimulation keine besondere Eigenschaft der im r28M-Molekül enthaltenen Spezifität für NG2 ist, und dass die supra-agonistische Aktivität nicht durch allogene Effekte bedingt ist.

• Bispezifische Antikörper zur selektiven Apoptoseinduktion über CD95 Basierend auf der Beobachtung, dass bispezifische F(ab‘)2-Fragmente mit Spezifität CD20 x CD95 in der Lage sind, in vitro, in humanen CD95-sensitiven, Zielantigen-positiven Lymphomzellen (SKW6.4) Apoptose zu induzieren [Jung et al., 2001], wurden verschiedene bispezifische F(ab‘)2-Fragmente mit Spezifität CD20 x CD95 in vitro näher charakterisiert und auf verschiedenen, unterschiedlich sensitiven B-Lymphomzelllinien untersucht. Erstmalig konnte in Immuntherapieversuchen in einem SCID-Maus-Xenograft-Modell gezeigt werden, dass solche bispezifischen F(ab‘)2-Fragmente auch in vivo eine effektive Tumorzelllyse vermitteln können. Zusätzlich wurde eine neue Variante der Stimulation des Todesrezeptors CD95 mit bispezifischen Antikörpern evaluiert: Ein rekombinanter monoklonaler Antikörper gegen CD20 wurde am C-Terminus mit einem c-myc-Epitop versehen. Durch eine Kombination mit einem bispezifischen F(ab‘)2-Fragment mit Spezifität anti-c-myc x anti-CD95 wurde es möglich, eine CD95-vermittelte Apoptose der Tumorzellen zu induzieren. Der wesentliche Vorteil dieses Ansatzes ist die Möglichkeit, ein universell einsetzbares bispezifisches F(ab‘)2-Fragment verwenden zu können, so dass nicht für jedes Zielantigen ein neues F(ab‘)2-Fragment aus den jeweiligen Ausgangsantikörpern hybridisiert werden muss. Dadurch kann die Problematik der aufwendigen Produktion bispezifischer Antikörper, die die klinische Applikation dieser Substanzen bis heute behindert, in der Zukunft deutlich abgemildert werden.

Die prä-klinischen Studien dieser Arbeit verdeutlichen das hohe Potential Antikörper-basierter Therapeutika die gegen das CD20-Antigen gerichtet sind und zeigen neue Wege auf, wie die therapeutische Aktivität von anti-CD20-Antikörpern verbessert werden kann.

Treatment of lymphoid malignancies has improved considerably over the last years due to antibody-based therapeutics. Nevertheless relapse remains a major problem and the development of innovative therapeutic options is highly desirable. The central aim of this thesis was the development and functional characterization of antibody-based immunotherapeutics. In this thesis the following molecules were produced and characterized which exert their therapeutic effects in different ways, but which are all directed against the CD20-antigen on lymphoma cells:

• Monospecific anti-CD20-antibodies with optimized Fc-part The success story of the chimeric monoclonal anti-CD20-antibody Rituximab demonstrates that monoclonal anti-CD20-antibodies are an efficient modality for the treatment of B-cell lymphomas. The antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADDC) plays an essential role in mediating this activity. Based on the work of Lazar et al. [Lazar et al., 2006] and using expression vectors developed by L. Große-Hovest (Department of Immunology, University of Tübingen) the amino acids S293 and I332 in the Fc-part of the anti-CD20-antibody 2H7 were exchanged to D293 and E332. This led to an increase in the efficacy of antibody-mediated cellular cytotoxicity by several orders of magnitude. In addition by a simple change of the expression cell line to the lower fucosylating YB2/0 cells a considerable increase of ADCC efficacy could be achieved. A combination of the mutation and expression approach did not further increase the ADCC-efficiency.

• Bispecific antibodies for a supra-agonistic T-cell stimulation via CD28 Certain bispecific antibodies mediate the activation of surface receptors in a target cell restricted way. In 2003 Grosse-Hovest et al. showed for the first time a target-cell restricted, supra-agonistic CD28-stimulation using a recombinant bispecific single-chain antibody with CD28 x NG2 specificity (r28M) [Grosse-Hovest et al., 2003]. In this thesis it could be demonstrated that the bispecific single-chain antibody r2820 with specificity for CD28 and CD20 has the ability to mediate a target-cell restricted, supra-agonistic T-cell stimulation and tumor cell lysis in an autologous sytem. Thus, target-cell restricted supra-agonistic CD28-stimulation is neither a property of the particular antibodies contained in the r28M molecule nor is it due to allogeneic effects.

• Bispecific antibodies for selective induction of CD95-mediated apoptosis Bispecific F(ab‘)2-fragments with CD20 x CD95 specificity are capable of inducing apoptosis in human CD95-sensitive, target-antigen positive lymphoma cells (SKW6.4) in vitro [Jung et al., 2001]. Therefore CD20 x CD95 bispecific F(ab‘)2-fragments were further analysed in vitro using cell lines of different sensitivity towards CD95-mediated cell death. Furthermore, it could be shown for the first time that such bispecific F(ab‘)2-fragments mediate a tumor cell lysis in a SCID-mouse-xenograft-model. Moreover a completely new approach for a stimulation of the CD95 death receptor was evaluated: A c-myc-epitope was attached to the C-terminus of a recombinant monoclonal anti-CD20-antibody and was used in combination with a bispecific F(ab‘)2-fragment with specificity anti-c-myc x anti-CD95. This combination of reagents induced a CD95-mediated apoptosis of the tumor cells. The main advantage of this approach is the ability to use a universal bispecific F(ab‘)2-fragment targeting tagged antitumor antibodies of different specificities. This attenuates the production problem for bispecific antibodies which hampered the clinical evaluation of these reagents over the years.

These preclinical studies indicate the high potential of CD20-directed, antibody-based therapeutics and show new approaches for the optimization of the therapeutic activity of anti-CD20-antibodies.