Optimierung der Strahlentherapie durch zielgerichtete Modulation von Apoptose-Signalwegen

Abstract

Strahlentherapie ist ein wesentlicher Bestandteil kurativer Behandlungsverfahren in der Therapie maligner Tumore. Allerdings zeigen einige Tumore (wie das Glioblastom) ein schlechtes Ansprechen auf Bestrahlung. Ursache hierfür sind u.a. Mutationen in Apoptose- und Überlebenssignalwegen, die während der Tumorentwicklung entstanden sind und zur Therapie-Resistenz der Tumorzellen beitragen können. Da die Induktion der Apoptose zur zytotoxischen Wirksamkeit der Bestrahlung beiträgt eröffnen Behandlungsansätze mit Substanzen, die direkt auf die gestörten Signalwege einwirken, die Möglichkeit die Strahlenresistenz zu überwinden. Ziel der vorliegenden Arbeit war daher zum einen, die Effizienz einer kombinierten Behandlung aus Bestrahlung und den membrangerichteten Alkylphosphocholinen ErPC bzw. ErPC3 in schwer therapierbaren malignen Gliomen zu beurteilen. Des weiteren sollte der molekulare Mechanismus der erhöhten Zytotoxizität nach kombinierter Behandlung im Gliomzell- sowie im Jurkat-Lymphomzellmodell analysiert werden. Außerdem sollten weitere Details zum Wirkmechanismus der Kombinationsbehandlung aus Bestrahlung und Stimulation des Zelltodrezeptorwegs im Jurkat-Modell untersucht werden. Dazu wurden der native Ligand TRAIL bzw. der gegen den TRAIL-Rezeptor 2 gerichtete agonistische Antikörper ETR-2 eingesetzt. Abschließend sollte an Jurkatzellen getestet werden, ob eine Dreifachkombination aus Bestrahlung, ErPC3 und TRAIL einen zusätzlichen Benefit zur Doppelbehandlung in der Therapie von Tumorzellen erzielen kann. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl ErPC als auch ErPC3 die Sensitivität maligner Gliomzellen (T98G, A172, U87MG) gegenüber strahleninduzierter Apoptose steigern. Dabei ergaben sich je nach eingesetzter Strahlendosis bzw. ErPC/ErPC3-Konzentration sub-additive bis synergistische Kombinationseffekte. Die sehr gute Kombinationswirkung für T98G konnte auch im klinisch relevanten Koloniebildungstest durch effiziente Reduktion der Koloniebildung bestätigt werden. Untersuchungen zum Zelltod nach kombinierter Behandlung enthüllten die Apoptose als wichtigen zytotoxischen Mechanismus, einhergehend mit Caspasen-Aktivierung und PARP-Spaltung. Dabei war der mitochondriale Zelltodweg entscheidend für die Apoptose-Induktion. In Jurkat Zellen kam ein zusätzlicher Verstärkerloop über retrograde Spaltung von Caspase 8 und Bid zum tragen. Als pro-apoptotische Effekte am Mitochondrium wurde in Glioblastomzellen eine zunehmende Aktivierung von Bax und eine Hochregulation von pro-apoptotischen BH3-only Proteinen beobachtet. Parallel dazu wurde PKB/Akt oberhalb des Mitochondriums durch Dephosphorylierung inaktiviert. Über die verminderte Phosphorylierung wurde die Aktivität des Transkriptionsfaktors FKHRL1 entsprechend erhöht, der u.a. die Transkription von Bim, Puma und Noxa induziert. Im Lymphomzellmodell verlangsamte die Überexpression von Bcl-2 die Effizienz der Behandlung, während das Fehlen von Bax und Bak zur vollständigen Blockade des Effekts führte. Hier scheint die Abnahme an anti-apoptotischem Mcl-1 für die pro-apoptotische Wirkung im Jurkat-Modell essentiell zu sein. In T98G konnte nach Kombinationsbehandlung aus Bestrahlung und ErPC3 über vermehrte -H2AX-Foci-Bildung eine verstärkte Induktion von Strahlenschäden aufgezeigt werden. Die Persistenz der Foci nach 24h spricht für irreparable Schäden an der DNA und somit für einen Beitrag von DNA-Schaden-vermittelter Apoptose am Gesamtzelltod. Des weiteren wurde das Zellzyklusprotein Rb durch aktivierte Caspasen abgebaut, wodurch seine hemmende Wirkung auf den Transkriptionsfaktor E2F1 entfällt. Dadurch könnten weitere apoptosefördernde Mechanismen in Gang gesetzt werden, die den mitochondrialen Zelltodweg unterstützen. Die Kombination aus Bestrahlung und TRAIL bzw. ETR-2 war sowohl in Bak-positiven als auch in Bak-negativen JCAM ein effizienter Auslöser von Apoptose. Trotz Abhängigkeit der strahleninduzierten Apoptose vom Vorhandensein des mitochondrialen Zelltodwegs war die Kombination aus Bestrahlung und Stimulation mit TRAIL bzw. ETR-2 in Bak-negativen Zellen nicht weniger effizient als in Bak-positiven. Damit sind mit diesen Kombinations-behandlungen optimale Voraussetzungen geschaffen, um Tumore mit schweren Defekten im mitochondrialen Zelltodweg effektiv in die Apoptose zu treiben. Die Dreifachbehandlung aus Bestrahlung, TRAIL und ErPC3 zeigte im getesteten Jurkat-Modell ausgezeichnete Kombinationswirkungen: Trotz starker Dosisreduktion von TRAIL und ErPC3 im Vergleich zur Zweifachkombination wurde bereits 12 h nach Dreifachbehandlung über 90% Apoptose nachgewiesen. Die in vitro erhobenen Daten zeugen von vielversprechenden Kombinationen aus Bestrahlung mit ErPC/ErPC3, Bestrahlung mit TRAIL/ETR-2 oder der Dreifachkombination aller getesteten Stimuli und machen sie zu aussichtsreichen und hoffnungsvollen Ansätzen bei der Therapie maligner Gliome und anderer solider Tumore mit ausgeprägter Resistenz gegenüber Bestrahlung und Chemotherapie.

Radiotherapy is an integral part of curative treatment concepts in the therapy of malignant glioma. However, some tumors (like glioblastoma) show high intrinsic resistance to radiotherapy. This can be caused by mutations in apoptosis and survival signaling pathways that raised during tumor development resulting to apoptosis resistance of tumor cells. Since induction of cell death including apoptosis conributes to the cytotoxic action of ionizing radiation, new treatment concepts targeting defective signaling pathways may be siuted to overcome treatment resistance. The aim of the present study was to evaluate the efficacy of combined treatment with ionizing radiation and the membrane targeted alkylphosphocholines ErPC and ErPC3 in highly resistant glioma cell lines. Moreover the molecular mechanism of increased cytotoxicity of combined treatment should be analyzed in glioma- and Jurkat-lymphoma cell-models. Besides, further details of the molecular mechanism after treatment with ionizing radiation and stimulation of cell death receptor pathway should be determined. For that purpose the native ligand TRAIL that acts via TRAIL receptor 1 and 2 as well as the activating agonistic antibody ETR-2 against TRAIL receptor 2 were used. Finally it should be determined in Jurkat cells whether triple combination of ionizing radiation, ErPC3 and TRAIL results in a further benefit compared to duplex combinations. In the present study ErPC and ErPC3 increased the sensitivity of malignant glioma cell lines (T98G, A172, U87MG) towards radiation-induced apoptosis. Dependent on radiation dose and used concentration of ErPC additive to synergistic combination effects could be observed. The excellent combination effect in T98G cells was further confirmed by efficient reduction of colonies in clinically relevant clonogenic survival assay. Investigations about cell death after combined treatment revealed apoptosis as important cytotoxic mechanism characterized by activation of caspases and PARP-cleavage. The mitochondrial cell death pathway was critical for induction of apoptosis in both cell types. In Jurkat cells an additional feedback loop via caspase 8 and Bid could be demonstrated. In glioblastoma pro-apoptotic effects on mitochondria involved increased activation of Bax as well as upregulation of pro-apoptotic BH3-only proteins. In parallel PKB/Akt was inactivating dephosphorylated upstream of the mitochondrion. Decreased phosphorylation of PBK/Akt resulted in increased activity of the transcription factor FKHRL1 which is responsible amongst others for the induction of Puma and Noxa. Overexpression of Bcl-2 decreased the efficacy of combined treatment in the Jurkat-lymphoma-model while deficiency of Bax and Bak resulted in a complete abrogation of the effect. Moreover the decrease of anti-apoptotic Mcl-1 seemed to be essential for the pro-apoptotic action in the Jurkat-model. In T98G an increased induction of radiation damage after combined treatment (ionizing radiation plus ErPC3) was identified by formation of -H2AX-foci. The persistence of these foci after 24h pointed to irreparable damaged DNA and therefore refers to a contribution of DNA-damage induced apoptosis on total cell death. In addition the cell cycle protein Rb was degraded by activated caspases which may abolish the inhibiting influence on the transcription factor E2F1. Thus, further apoptosis-promoting mechanisms could be implemented that support the mitochondrial cell death pathway. Combined treatment with ionizing radiation and TRAIL or ETR-2 efficiently induced apoptosis in Bak-positive as well as in Bak-negative JCAM cells. Despite dependence of radiation-induced apoptosis by an intact mitochondrial cell death pathway combined treatment (ionizing radiation plus TRAIL or ETR-2) was not less efficient in Bak-negative than in Bak-positive JCAM. Therefore these combined treatment settings are an optimal prerequisite to force tumor cells with severe defects in mitochondrial cell death execution effectively into apoptosis. The triple treatment with ionizing radiation, TRAIL and ErPC3 showed excellent efficacy in the Jurkat-model: Despite strong dose reduction of TRAIL and ErPC3 compared to duplex treatments more than 90% apoptosis was observed already 12h after triple treatment. The in vitro results attest antineoplastic activity of radiation and ErPC/ErPC3, radiation and TRAIL or ETR-2 as well as triple treatment making these combined treatment settings promising new approaches for therapy of malignant glioma or other tumors highly resistant towards radiation or chemotherapy.