HLA-Ligandom-, Genexpressions- und T-Zell-Analysen zur Identifizierung tumorassoziierter Peptide des Nierenzellkarzinoms und der Akuten Myeloischen Leukämie

Abstract

Immuntherapeutische Strategien sind vielversprechende Ansätze in der Therapie maligner Erkrankungen. Schlüsselstruktur für die Erkennung maligner Zellen durch die T-Zellen des Immunsystems sind tumorassoziierte, HLA-präsentierte Peptide. Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war es, das HLA-Ligandom neoplastischer Zellen durch massenspektrometrische (LC/MS) Peptidsequenzierung näher zu charakterisieren, sowie mit Hilfe der Microarray-basierten Genexpressionsanalyse solche Gene bzw. Proteine zu identifizieren, die aufgrund ihres Expressionsmusters als tumorassoziiert anzusehen sind. Analysiert wurden solide Nierenzellkarzinome (RCC) sowie Zelllinien der Akuten Myeloischen Leukämie (AML) und des RCC. Insgesamt konnten 725 verschiedene Peptidsequenzen aus 11 soliden RCCs und 204 Peptide aus einer RCC-Zelllinie gewonnen werden. Die meisten dieser HLA-Liganden entsprachen sog. "Selbstpeptiden", für die sich keine Hinweise auf eine Tumorassoziation ergaben. Jedoch konnten sowohl in den soliden Tumoren als auch in der Zelllinie zahlreiche neue Peptide aus bereits etablierten tumorassoziierten Proteinen (MET, ADFP, CA9, CCND1, RPL10A) sowie aus Proteinen, deren korrespondierende Genexpression eine Tumorassoziation nahe legt (MMP7, APOL1, ACSL4, IGFBP3, RGS5, EIF3S6, FABP7, KNTC2, ECT2, CCDC99, EGLN3), identifiziert werden. Weiter konnte gezeigt werden, dass die primäre Zelllinie in vitro mit ihrem Ursprungsgewebe, dem soliden Tumor in vivo hinsichtlich ihrer Genexpression kaum und hinsichtlich ihrer Peptidpräsentation praktisch nicht korrespondiert. Der endgültige Nachweis der Immunogenität einiger der identifizierten Peptide konnte in durchgeführten T-Zellstimulationsversuchen aufgrund methodischer Probleme leider nicht erbracht werden. Die Analyse des HLA-Ligandoms dreier AML(inv16)-Proben führte zur Sequenzierung von 268 Peptiden, unter ihnen HLA-Liganden aus potentiell tumorassoziierten Proteinen wie MYC, PIM1, MPL, MKI67, EIF3S6, TOP2A und HDC. Peptide aus dem für die AML(inv16) charakteristischen Fusionsprotein CBFb-MYH11 konnten trotz intensiver Suche nicht nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit konnten zahlreiche neue HLA-Liganden aus genexpressionsanalytisch tumorassoziierten Proteinen sowie vorbeschriebenen tumorassoziierten Proteinen sequenziert werden, die in Vaccinierungsstudien im metastasierten Nierenzellkarzinom verwendet werden können und zum Teil bereits verwendet werden.

Immunotherapeutic strategies are promising approaches in the therapy of several malignancies. HLA-presented tumour-associated peptides are key-structures for the cytotoxic T-lymphocyte-based recognition of malignant cells by the immune system. The objective of this work was to define a larger number of such targets using a combined approach involving HLA ligand characterization by mass spectrometry (LC/MS) and gene expression profiling by oligonucleotide microarrays. Solid renal cell carcinomas (RCC) as well as RCC cell lines and acute myeloid leukaemia (AML) cell lines were analyzed. Overall, 725 different peptide sequences were identified on 11 solid RCCs as well as 204 different peptides on a RCC cell line. Most of these peptides derived from self-proteins without any evident tumour association. However, both in the solid tumours and in the cell line, numerous HLA ligands derived from previously known tumour antigens in RCC (MET, ADFP, CA9, CCND1, RPL10A) were identified. In addition, gene expression profiling of tumours and a set of healthy tissues revealed novel candidate RCC-associated antigens (MMP7, APOL1, ACSL4, IGFBP3, RGS5, EIF3S6, FABP7, KNTC2, ECT2, CCDC99, and EGLN3). Further, comparing the gene exprssion profile and the peptide presentation pattern of a solid RCC and its autologues cell line, we could show, that there is only a week coherence in gene expression and nearly no coherence in the peptide presentation in the in vitro- compared with the ex vivo- situation. The final proof of the immunogenicity of some of the identified peptides unfortunately could not be demonstrated in the conducted T-cell stimulation assays, due to methodical problems. The analysis of three AML(inv16)-specimens led to the sequencing of 268 peptides, among them HLA ligands processed out of potentially tumour associated proteins such as MYC, PIM1, MPL, MKI67, EIF3S6, TOP2A and HDC. Despite intensive search, peptides derived from the fusion protein CBFb-MYH11, which is characteristic for AML(inv16), could not be identified. In this work, numerous new HLA ligands processed out of previously described tumor associated proteins could be identified. Additionally numerous peptides derived from proteins which are tumour associated due to their gene expression profile could be sequenced. Most of these Peptides can be used in vaccination trials of metastatic renal cell carcinoma and partially are already used.