Isolierung und Identifizierung der hauptaktiven antitrypanosomalen Komponente des Viperngiftes von Eristocophis macmahoni und ihre Effekte auf Trypanosoma brucei

Abstract

Das Gift der Blattnasenviper Eristocophis macmahoni wurde bezüglich seiner toxischen Effekte auf den einzelligen Parasiten und Schlafkrankheitserreger Trypanosoma brucei untersucht. Ein IC50-Wert von 198 ng/ml wurde für Blutformparasiten bestimmt. Per Transmissionselektronenmikroskopie wurden autophagische Strukturen, membrane blebbing und Störungen des Cytoskeletts beobachtet. Zur Isolierung und Identifizierung der hauptaktiven Giftkomponente wurde eine aktivitätsgerichtete Aufreinigung unter Verwendung mehrerer HPLC-Schritte durchgeführt. Die durch Gelfiltrationschromatographie erhaltene aktivste Fraktion wurde mit Hilfe von Hydrophiler Interaktionschromatographie (HILIC) weiter aufgetrennt. In der aktivsten HILIC-Fraktion wurde durch off-line ESI-MSn das Polyamin Spermin identifiziert, dessen Anteil an der gesamten Trockenmasse des Gifts auf ca. 1% bestimmt wurde. Die IC50 von reinem Spermin bei Blutformtrypanosomen betrug 3,5 µM. Die Analyse im Transmissionselektronenmikroskop zeigte das Auftreten von Autophagie, wenngleich die beobachteten Effekte nicht durch bekannte Autophagieinhibitoren aufgehoben werden konnten. Es wird jedoch angenommen, dass Autophagie in Trypanosomen auf eine andere Weise abläuft als in den meisten anderen Eukaryonten. In FACS-Experimenten wurden Nekrose und Apoptose ausgeschlossen. Versuche mit Pferdeserum bzw. Katalase zeigten die Beteiligung einer Polyaminoxidase(PAO)-Aktivität des im verwendeten Kulturmedium enthaltenen fötalen Kälberserums trotz ausgiebiger Hitzeinaktivierung. Abbau von Spermin zu toxischen Aldehyden und H2O2 durch Serum-PAO und resultierende trypanozide Effekte wurden bereits zuvor gezeigt. Wenn Schlangengift jedoch in Medium ohne PAO-Aktivität eingesetzt wurde, erfolgte offenbar eine Oxidation von Spermin durch intrinsische Giftkomponenten, was eine wichtige synergistische Funktion von Polyaminen in Schlangengift offenlegen könnte: die Bildung toxischer Metabolite nach Injektion des Gifts in das Blut des Opfers unabhängig von der Präsenz einer PAO im betroffenen Organismus.

The venom from the leaf-nosed viper Eristocophis macmahoni was analyzed regarding its toxic effects on the unicellular parasite Trypanosoma brucei, the causative agent of sleeping sickness. An IC50 value of 198 ng/ml was measured using bloodstream form parasites. By means of transmission electron microscopy, autophagic structures, membrane blebbing and cytoskeletal disorder were detected. An in vitro activity-directed isolation procedure including several HPLC separation steps was applied in order to identify the major trypanocidal compound. A primary size exclusion chromatography step yielded a fraction with maximum antitrypanosomal activity that was further separated by hydrophilic interaction chromatography (HILIC). By analysis of the most active HILIC fraction using off-line ESI-MSn, the polyamine spermine was identified. Quantification of spermine within the venom showed this compound to constitute approximately 1% of the dry venom mass. Pure spermine had an IC50 value of 3.5 µM in bloodstream form T. brucei and was shown to induce autophagy in the parasites using transmission electron microscopy, even though known inhibitors of autophagy were not able to block the observed effects. However, autophagy is expected to occur in trypanosomes in a way different from most other eukaryotes. Necrosis or apoptosis were excluded by means of FACS and electron microscopic analyses. Experiments with horse serum or catalase, respectively, showed the involvement of a polyamine oxidase (PAO) activity in the fetal calf serum used for cultivation of the parasites despite excessive heat inactivation. Degradation of spermine to toxic aldehydes and H2O2 by serum PAO resulting in trypanocidal effects had been shown previously. When crude venom was applied in media without PAO activity, spermine was apparently also oxidized by intrinsic venom components, suggesting an important synergistic function of polyamines in snake venoms: the generation of toxic metabolites upon injection into the victim’s blood independently from a possible presence of polyamine oxidase in the respective organism.