Parallel and miniaturised Analysis of Protein-Protein Interactions in T-Cell Signal Transduction by Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy and Peptide Microarrays

Abstract

The aim of this thesis was to develop methods for the parallel analysis of complexes of endogenous proteins in T-cell signal transduction. We opted for detection in cell lysates, as the labelling of proteins in lysates is more versatile and more amenable to parallelisation compared to the labelling of proteins in life cells. Two approaches were developed, based on peptide microarrays and on fluorescence correlation and cross correlation spectroscopy (FCS / FCCS). It is shown that peptide microarrays provide a robust and quantitative means for detecting signalling-dependent changes of protein interactions. Recruitment of a protein into a complex leads to the masking of an otherwise exposed binding site. In cell lysates this masking can be detected by reduced binding to a microarray carrying a peptide corresponding to the binding motif of the respective interaction domain. This approach provides a significant shortcut to the detection of molecular interactions. It was first exemplified for the binding of ZAP70 to a bis-pY-motif of the activated T-cell receptor via its tandem SH2 domain. The activation-dependent recruitment of ZAP70 into signalling complexes reduced the microarray-bound signal, providing quantitative information on the change of the fraction of available binding sites. The concept was extended with microarrays comprising 24 peptides representing binding motifs for SH2, SH3, PTB WH1 and PDZ domains. Lysates of resting or stimulated Jurkat cells were incubated on these arrays and the binding of two signalling proteins per array was detected by two-colour indirect immunofluorescence. With 16 arrays per slide incubated in parallel, this approach yields 768 data points on protein-protein interactions in cellular signalling per slide. In addition to changes caused by the masking of binding sites, recruitment of proteins into complexes also lead to signal changes. This endows the arrays with properties of co-purification methods, but in a highly parallel and miniaturised fashion. Competition with peptides corresponding to interaction motifs dismantled complexes on the arrays in a stepwise and dose dependent manner and provided detailed information on the architecture of signalling complexes. For stimulation of Jurkat cells through receptor crosslinking with anti-CD3 and/or anti-CD28 antibodies, the timecourse of the changes in the pattern of molecular interactions could be monitored. Experiments with Jurkat cell derivatives lacking key signalling components demonstrated that the peptide arrays provide a means to dissect functional interdependences in cellular signalling networks. FCCS and FCS were used to detect interactions of endogenous signalling proteins using simple “mix, incubate, and measure” protocols in microliter volumes of crude cell lysates. Both binding partners of interest were targeted by indirect immunolabelling. Using 384-well plates, measurements were conducted in 20 microlitres crude cell lysate per sample, corresponding to 0.2 - 1 * 10^6 cells. Matched pairs of primary antibodies against the interaction partners and labelled secondary reagents were all added to the crude cell lysates in one step. FCCS, using two spectrally different fluorophores as labels, proved superior to FCS, using one fluorophore and one mass-tag. The one-step addition of reagents and separation-free detection minimise the number of manipulations required for complex detection and make the protocol readily compatible with automation. The method was applied for detecting the signalling-dependent formation of molecular complexes in T-cell signal transduction and for determination of IC50 values for substances interfering with protein-protein interactions. Competition experiments with peptides disrupting interactions constituting a central protein complex in T-cell signalling, the LAT-signalosome, revealed their relative contributions to stabilising the complex. In conclusion, the FCCS-based approach for protein complex detection is well suited for the parallel detection of a set of protein-protein interactions within a cellular signalling network. In applications relating to systems biology, data sets on the evolution of interactions over time in response to different stimuli may be generated with comparably little effort. Here, the ability to work endogenous proteins is especially advantageous, as overexpression of fusion-proteins with detection tags may distort signalling by driving the formation of protein complexes. Other applications are the screening for inhibitory substances of protein-protein interactions and ranking of inhibitors according to their IC50 values. Especially for interactions depending on signalling-dependent posttranslational modifications, an approach based on unmodified cellular systems is preferable over reconstituted systems. Future applications may also be in the screening for new interactions and the generation of interaction maps using libraries of antibodies.

Ziel dieser Doktorarbeit war, im Kontext der T-Zell-Signaltransduktion Methoden zur parallelen Analyse von Komplexen endogener Proteine zu entwickeln. Dabei wurde auf die Markierung von Proteinen im Zelllysat gesetzt, da diese flexibler einsetzbar und daher einfacher parallelisierbar ist als die Markierung von Proteinen in lebenden Zellen. Zwei Methoden wurden entwickelt, basierend auf Peptidmikroarrays und auf Fluoreszenz-Korrelations- und Kreuzkorrelations-Spektroskopie (FCS / FCCS). Die Arbeit zeigt, dass Peptidmikroarrays einen einfachen Weg zur quantitativen Detektion signalabhängiger Protein-Protein-Interaktionen eröffnen. Die Komplexierung eines Proteins maskiert eine andernfalls frei zugängliche Bindungsstelle. In Zelllysaten lässt sich so eine Maskierung detektieren, indem sie die Bindung des Proteins an einen Array vermindert, der ein zu der maskierten Bindungsstelle passendes Peptid-Motiv trägt. Dieser Effekt wurde validiert anhand der Bindung der SH2-Domänen von ZAP70 an ein bis-pY-Motiv des aktivierten T-Zell-Rezeptors. Die aktivierungsabhängige Einbeziehung von ZAP70 in Signalproteinkomplexe reduzierte das Fluoreszenzsignal auf dem Mikroarray. Aus der Signalreduktion ließ sich Änderung des Anteils verfügbarer Bindungsstellen ableiten. Der Ansatz wurde ausgeweitet, indem Mikroarrays mit 24 Peptiden, Repräsentanten für Bindemotive von SH2-, SH3-, PTB-, WH1- und PDZ-Domänen, eingesetzt wurden. Lysate ruhender oder stimulierter Jurkat-Zellen wurden auf den Arrays inkubiert und die Bindung von zwei Signaltransduktionsproteinen pro Array durch indirekte Immunfluoreszenz detektiert. Durch parallele Inkubation von 16 Mikroarrays pro Objektträger lieferte ein Experiment 768 Datenpunkte zu Interaktionen in der zellulären Signaltransduktion. Neben Maskierungseffekten führte auch die Einbeziehung von Proteinen in Komplexe zu Signaländerungen, analog zu Ko-Aufreinigungsmethoden, aber in paralleler und miniaturisierter Weise. Kompetitionen mit Peptiden, die den Bindemotiven innerhalb der Komplexe entsprachen, ermöglichten die schritt¬weise und konzentrationsabhängige Zerlegung der Komplexe auf den Arrays und lieferten somit detaillierte Informationen zur Komplexarchitektur. Nach Rezeptor-Kreuzvernetzung durch anti-CD3 und/oder anti-CD28 ließ sich der Zeitverlauf von Änderungen im Muster molekularer Interaktionen beobachten. In Experimenten mit Jurkat-Zellen, denen Schlüsselkomponenten der Signaltransduktion fehlten, zeigten die Peptidarrays funktionale Zusammen¬hänge im zellulären Signalnetzwerk. FCS und FCCS wurden genutzt, um Interaktionen endogener Signaltransduktions-Proteine in einfachen „Misch, inkubier und miss“-Protokollen in Mikrolitervolumina von Zelllysat zu detektieren. Beide hinsichtlich ihrer Bindung zu untersuchenden Proteine wurden indirekt immunmarkiert. Die Messungen wurden in Multititerplatten mit 384 Probenkammern in jeweils 20 micro-l Lysat pro Ansatz (entsprechend 0,2 – 1,0 * 10^6 Zellen) durchgeführt. Abgestimmte Paare von Primärantikörpern und markierten Sekundärreagenzien wurden in einem Schritt zu den Lysaten gegeben. FCCS mit zwei spektral unterschiedlichen Fluorophoren als Markierung erwies sich als sensitiver und robuster als FCS mit einem Fluorophor und einem Nanopartikel als Massenmarkierung. Die gleichzeitige Zugabe aller Reagenzien minimiert den Handhabungsaufwand und macht die Methode kompatibel für die Automatisierung. Bisher wurde sie für die Detektion signalabhängiger Proteinkomplexe in der T-Zell-Signaltransduktion und für die Bestimmung von IC50-Werten für Inhibitoren der Komplexbildung eingesetzt. Titrationsexperimente mit Peptiden, die die individuellen Interaktionen innerhalb des LAT-Signalosoms kompetieren, zeigten die relative Bedeutung der einzelnen Interaktionen für die Stabilisierung des gesamten Komplexes. Zusammenfassend ist der FCCS-basierte Ansatz gut geeignet, um mehrere Interaktionen innerhalb eines zellulären Signalnetzwerkes parallel zu verfolgen, beispielsweise in systembiologischen Fragestellungen. Datensätze zur Entwicklung von Interaktionen über die Zeit und in Antwort auf unterschiedliche Stimuli können so mit vergleichsweise wenig Aufwand gewonnen werden. Vorteilhaft ist, in Systemen mit ausschließlich endogenen Proteinen arbeiten zu können, da die Überexpression von Fusionsproteinen mit Detektions¬markierungen die Bildung von Proteinkomplexen favorisieren und das zelluläre Signalgeschehen verzerren könnte. Eine weitere Anwendung kann die Reihenuntersuchung potentieller Inhibitoren von Interaktionen sein. Inhibitorkandidaten ließen sich dabei anhand ihres IC50-Wertes vergleichend beurteilen. Da viele Interaktionen auf posttranslationalen Modifikationen beruhen, ist ein auf endogenen Proteinen in ihrem natürlichen zellulären Kontext basierender Ansatz einem rekonstitutierten System vorzuziehen. Zukünftig könnte die Methode auch für die Neuidentifikation von Interaktionen mit Hilfe von Antikörper-Bibliotheken eingesetzt werden.