Inhaltszusammenfassung:
Das Ohr vereint das Hör- und Gleichgewichtsorgan, wodurch es zu einem der wichtigsten Sinnesorgane des Körpers zählt. Das Gehör ist dabei von essenzieller Bedeutung für die Sprachentwicklung des Menschen. Des Weiteren ist das Gleichgewichtsorgan verantwortlich für die Aufnahme von Bewegungsreizen und zur Orientierung der Lage des Kopfes im Raum. Die Innenohrschwerhörigkeit zählt weltweit zu dem am häufigsten auftretenden Sinnesverlust. Ursächlich ist dabei, dass die Haarzellen im Corti Organ nicht regenerationsfähig sind und ihre Anzahl begrenzt ist. Zurzeit sind die Behandlungsmöglichkeiten der Innenohrschwerhörigkeit noch begrenzt. Zu den Therapiemöglichkeiten, welche bereits bestehen, gehört unter anderem die Anlage eines Cochleaimplantates. Um die Forschung auf diesem Gebiet voranzubringen, können in vitro-Modelle von großem Nutzen sein. Hierfür sind hiPSZ eine bereits etablierte Alternative, wobei ihre Kultivierung mit Hilfe spezialisierter Medien von zentraler Bedeutung ist. Aus hiPSZ können im in vitro-Modell organähnliche 3D Organoide erzeugt werden, wodurch ein definierter Zeitraum der Embryonalentwicklung nachempfunden werden kann. So lassen sich hierdurch auch in vivo-Studien an Tiermodellen vermeiden.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle zweier definierter Kulturmedien für Stammzellen und deren Einfluss auf die Kultivierung, sowie den weiteren Verlauf der frühen otischen Entwicklung, genauer untersucht. Die Stammzellmedien werden unter anderem benötigt, damit keine ungerichtete Differenzierung abläuft. Um die Entwicklung darzustellen, wurde ein etabliertes Differenzierungsprotokoll verwendet, womit 3D Organoide erzeugt werden konnten. Zur Generierung der 3D Organoide wurden hiPSZ aus Keratinozyten erzeugt und in zwei verschiedenen Stammzellmedien kultiviert. Hierbei handelt es sich zum einen um das kommerziell erhältliche PeproGrow™ Medium von PeproTech und das von Frank et al., 2012 entwickelte, sowie selbst hergestellte FTDA-Medium.
Im Verlauf wurden zu verschiedenen Zeitpunkten der Differenzierung (Tag 6,12 und 20) Proben für Immunologische- und RNA-Analysen entnommen. Die Organoide wurden mit Hilfe von Immunfluoreszenzfärbung und Fluoreszenzmikroskopie auf spezifische Proteine der otischen Entwicklung hin untersucht. Die RNA- Analyse erfolgte zur Erfassung der Genexpression.
Ziel der Arbeit war es, zu evaluieren, ob und inwiefern die gezielte Differenzierung in otische Zelllinien durch das jeweilige Stammzellmedium unterstützt und beeinflusst werden kann, inwieweit sich dabei Unterschiede zwischen den Bedingungen zeigen und ob eines der beiden Medien, gegenüber dem anderen, für die otische Differenzierung besser geeignet ist. Beide Medien ermöglichten grundsätzlich die Kultivierung von hiPSZ unter feederfreien Bedingungen. Unterschiede zeigten sich jedoch in der Progression der otischen Entwicklung. Dabei wurde insbesondere das Expressionsprofil spezifischer Marker analysiert, die für die otische Entwicklung charakteristisch sind (u. a. PAX8, SOX2 und SOX9).
Die Resultate deuten darauf hin, dass die spezifische Zusammensetzung des Mediums einen Einfluss auf die Qualität, sowie auf die Richtung der Differenzierung ausübt. Beide Stammzellmedien zeigten unter optimierten Bedingungen vergleichbare RNA-Expressionswerte und auch vergleichbare morphologische Muster in Bezug auf die Proteinexpression zu den frühen Zeitpunkten an Tag 6, 12 und 20. Lediglich an Tag 12 wurde eine signifikant höhere Expression von EYA2 im FTDA-Medium festgestellt, wodurch sich hier kein Vorteil eines der Medien gegenüber dem anderen ableiten ließ. Hinsichtlich der Optimierung und Modifizierung bereits bestehender Formulierungen von selbst hergestellten Stammzellmedien, wie z.B. FTDA, kann jedoch ein großes Potenzial für die gezielte Erforschung spezifischer Differenzierungsprozesse, wie z.B. der otischen Differenzierung bestehen.
So liefern diese Ergebnisse wertvolle Hinweise für die Weiterentwicklung kosteneffizienter, leistungsfähiger und optimal abgestimmter Stammzell- und Kulturmedien für die otische Differenzierung.
