Establishment of a method for the isolation of monocytes from human whole blood and their differentiation to polarized macrophages to analyze immunomodulatory characteristics of biomaterials

Abstract

Zahnverlust stellt ein erhebliches Problem dar, das vor allem durch Karies, schwere Parodontitis und Traumata verursacht wird und unter anderem zu Einschränkungen des Kauens und des Sprechens führt. Aufgrund ihrer vorteilhaften Funktion und Ästhetik sowie ihrer vielversprechenden Langzeitergebnisse haben sich Zahnimplantate hier zu einer wichtigen Therapieoption entwickelt. Periimplantärer Knochenverlust stellt jedoch ein zunehmendes Problem dar und kann bis hin zu Implantatversagen führen, weil derzeit zuverlässige Lösungsansätze fehlen. Marginaler Knochenverlust wird auf Immunprozesse im Sinne einer anhaltenden oder wiederkehrenden Fremdkörperreaktion (FRB) zurückgeführt, bei der auf zellulärer Ebene Makrophagen (MΦ) vorherrschen. Bemühungen zur Überwindung des periimplantären Knochenverlusts sollten sich daher auf die FBR mit Schwerpunkt auf MΦ konzentrieren. Dementsprechend strebte diese Studie die Etablierung eines Protokolls zur zuverlässigen und reproduzierbaren Isolierung und Differenzierung humaner peripherer Blutmonozyten mit anschließender Polarisation hin zu aus Monozyten gewonnenen MΦ (MdM) an, um anschließend die Kenntnisse über die FBR zu vertiefen und immunmodulatorische Einflüsse von Biomaterialien in vitro zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden Monozyten aus dem peripheren Vollblut gesunder Spender mittels Dichtegradientenzentrifugation und anschließender Monozytenadhäsion isoliert. Die letzteren Zellen wurden sodann mittels 10 ng/ml MΦ koloniestimulierendem Faktor (M-CSF) für 6 Tage zu MdM differenziert. Für die M1-Polarisation wurden die MdM anschließend mit 50 ng/ml Interferon g (IFNg) und 10 ng/ml Lipopolysaccharid (LPS) inkubiert, wohingegen die M2-Polarisation mittels 20 ng/ml Interleukin (IL) 4 und 20 ng/ml IL13 hervorgerufen wurde. Die MdM wurden anschließend lichtmikroskopisch bezüglich ihrer Morphologie charakterisiert. Des Weiteren wurden die Zytokinsekretion mittels Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), die Markerexpression mittels Durchflusszytometrie sowie die Morphologie des Zytoskeletts und die Oberflächenmarkerexpression mittels konfokaler Laser-Scanning Mikroskopie (CLSM) untersucht. Zur Implementierung des etablierten Protokolls wurden anschließend differenzierte MdM auf verschiedenen Oberflächen, darunter machiniertes Titan (Ti-ma Disks), sandgestrahltes und säuregeäztes Titan (Ti-SLA Disks) und Titan Anatas (Ti-Ana Disks), ausgesät und polarisiert. Mögliche immunmodulatorische Wirkungen wurden mittels Cell Counting Kit (CCK) 8 Zellproliferationsassay, ELISA, Bicinchoninsäure (BCA) Assay und CLSM überprüft. Bezüglich der Charakterisierung zeigen M1-MdM morphologisch einen runden Phänotyp und sind zuverlässig durch die Sekretion des proinflammatorischen Tumornekrosefaktors (TNF) a sowie durch die Expression des Chemokin C-C Motiv Rezeptors (CCR) 7 gekennzeichnet. M2-MdM hingegen weisen einen eher elongierten Phänotyp auf, sezernieren spezifisch den Chemokin C-C Motiv Liganden (CCL) 13 und CCL17 und exprimieren Cluster of Differentiation (CD) 1A sowie CD209. Hinsichtlich immunmodulatorischer Effekte der untersuchten Titanoberflächen wurde zunächst eine direkte negative Auswirkung der Ti-ma Disks, der Ti-SLA Disks sowie der Ti-Ana Disks auf die ausgesäten MdM mittels CCK8 Zellproliferationsassay ausgeschlossen. Bezüglich der Zytokinsekretion bewirkte keine der untersuchten Oberflächen eine Erhöhung von TNFa, so dass ein signifikanter proinflammatorischer Einfluss ausgeschlossen werden konnte. Die CCL13 Konzentration als Marker der M2-Polarisation war hingegen bei den M0-MdM und den M2-MdM, welche auf Ti-Ana Disks ausgesät wurden, im Vergleich zu den Coverslips beziehungsweise den Ti-ma Disks signifikant reduziert. Schließlich wurden die Morphologie des Zytoskeletts sowie die Expression von Oberflächenmarkern der MdM untersucht. Hierbei ergaben sich weder deutliche morphologische Abweichungen noch signifikante Unterschiede in der Expression von CCR7 und CD209 zwischen den Ti-ma Disks, den Ti-SLA Disks und den Ti-Ana Disks, sodass keine der untersuchten Oberflächen eine signifikant erhöhte pro- oder antiinflammatorische Wirkung aufweist. Das etablierte Protokoll ermöglicht folglich die reproduzierbare Gewinnung und Charakterisierung von differenzierten und polarisierten MdM. Mittels der letzteren Zellen können sodann die Erkenntnisse über die FBR vertieft und immunmodulatorische Effekte von Biomaterialien in vitro untersucht werden.

The loss of teeth is a remarkable issue predominantly resulting from caries-related decay, severe periodontitis and trauma concomitant with, amongst others, limitations upon mastication and phonetics. By reason of their beneficial function and aesthetics along with promising long-term results, dental implants have evolved into a major therapeutic option. However, peri-implant bone loss constitutes an increasing problem and can lead up to implant failure, as reliable solution approaches are currently lacking. Marginal bone loss is ascribed to immune processes in terms of a continuing or recurrent foreign body reaction (FBR) in which macrophages (MΦ) prevail. Efforts to overcome peri-implant bone loss should therefore strive for the disclosure of the FBR focusing on MΦ. Accordingly, this study aimed at the establishment of a protocol to reliably and reproducibly isolate and differentiate human peripheral blood monocytes to polarized monocyte-derived MΦ (MdM) to subsequently engross insights into the FBR and investigate immunomodulatory effects of biomaterials in vitro. To this, monocytes were isolated from peripheral whole blood of healthy donors by density gradient centrifugation and subsequent monocyte adhesion. These cells were then differentiated to MdM using10 ng/ml MΦ colony stimulating factor (M-CSF) for 6 days. Subsequently, for M1 polarization, MdM were incubated with 50 ng/ml interferon g (IFNg) and 10 ng/ml lipopolysaccharide (LPS), whereas M2 phenotype was induced using 20 ng/ml interleukin (IL) 4 and 20 ng/ml IL13 for 2 days. MdM were then light microscopically characterized as to their morphology. Furthermore, cytokine secretion using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), marker expression deploying flow cytometry and cytoskeletal morphology as well as surface marker expression utilizing confocal laser scanning microscopy (CLSM) were assessed. As to the implementation of the established protocol, differentiated MdM adjacently were cultured and polarized on diverse titanium (Ti) surfaces including Ti-machined (Ti-ma), sandblasted with large grits and acid-etched titanium (Ti-SLA) as well as Ti-anatase (Ti-Ana) discs and immunomodulatory effects were evaluated via cell counting kit (CCK) 8 cell proliferation assay, ELISA, bicinchoninic acid assay (BCA protein assay) and CLSM. Resultantly, M1-MdM morphologically exhibit a round phenotype and are reliably characterized by secretion of proinflammatory tumor necrosis factor (TNF) a as well as expression of chemokine C-C motif receptor (CCR) 7. M2-MdM, in contrast, are rather elongated, specifically secrete chemokine C-C motif ligand (CCL) 13 and CCL17 and exhibit significantly increased levels of cluster of differentiation (CD) 1A and CD209. As to immunomodulatory effects of diverse titanium surfaces, CCK8 cell proliferation assay was conducted at first to preclude direct adverse effects of Ti-ma discs, Ti-SLA discs and Ti-Ana discs on the cultivated MdM. Concerning cytokine secretion, neither of the surfaces investigated effectuated increased level of TNFa secretion, thus, foreclosing significant pro-inflammatory influences. CCL13 concentration as marker of the M2-polarization, on the other hand, was significantly reduced for M0-MdM or M2-MdM seeded on Ti-Ana discs as compared to coverslips or Ti-ma discs, respectively. Lastly, cytoskeletal morphology as well as surface marker expression of the MdM cultivated on Ti-ma discs, Ti-SLA discs and Ti-Ana discs was assessed, neither disclosing distinct morphologic discrepancies nor revealing significant differences of CCR7 and CD209 expression. Hence, none of the surfaces investigated exert significantly more pronounced pro- or anti-inflammatory effects as compared to the residual surfaces. Accordingly, the established protocol allows for a reproducible preparation and characterization of differentiated and polarized MdM. These cells subsequently render possible to further delve into the FBR and investigate immunomodulatory effects of biomaterials in vitro.