Generation of keratinocyte-derived induced pluripotent stem cells using a novel hair sampling platform

Abstract

Die Hauptidee war einen Probenträger zu entwickeln für eine Probensammlung mit minimaler Invasivität und Zeitanforderung, um eine Probensammlung in verschiedensten Nationen und Umgebungen zu ermöglichen. Wir wollten außerdem einen einfachen Weg zum Probentransport finden mit minimalen negativen Einflüssen auf die Proben. Zusätzlich wollten wir das Super Keratinocyte Gel (SKG) Protokoll erstellen durch Modifizierung des gut etablierten Reprogrammierungsprotokolls von Aasen und Belmonte 2010. Zu diesem Zweck wählten wir den Sendai Virus als Übertragungsvektorsystem (Li et al. 2000). We wollten das SKG Protokoll hinsichtlich Zeitbedarf und Effektivität optimieren.

Um das modifizierte Protokoll zu erstellen sammelten wir Haarproben und verglichen das klassische Protokoll und den SKG Protoyp als Plattform zur Kultivierung von Keratinozyten. Als nächstes testeten wir das Einfrieren und Auftauen der beladenen Prototypen als mögliche Transport- und Lagerungsmöglichkeit. Da wir darauf abzielten, ein Protokoll anzuwenden, welches nahezu jede Person in die Lage des möglichen Probensammlers versetzt, untersuchten wir den Effekt der Evaporation auf die Auswachsrate der Haare während es Beladungsprozesses des Prototypen. Als weitere zeitsparende Möglichkeit versuchten wir die mit Haaren beladenen Prototypen erneut auszuplatieren und anzuzüchten nachdem das erste Auswachsen der Keratinozyten erreicht war. Schlussendlich verglichen wir die ammenzellassistierte und die ammenzellfreie Reprogrammierung der Keratinozyten in humane induzierte pluripotente Stammzellen unter Nutzung unseres entwickelten Protokolls hinsichtlich Zeitaufwand und Effektivität. Die Haupterfolge dieses Forschungsprojekts sind: I) Die Etablierung des SKG Systems als eine valide Probenplattform für Sammlung, Transport und Kulturierung von Keratinozyten. II) Die weitere Reduzierung von Zeit und Arbeitsaufwand zur Erstellung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen durch erneutes Ausplatieren und Reprogrammieren unter Nutzung des Sendai Virus und des optimierten SKG Protokolls.

Alles in allem ist das SKG System ein großartiges Werkzeug zur nicht invasiven, massenhaften Probensammlung mit sehr geringen Anforderungen hinsichtlich materieller oder personeller Voraussetzungen. Das in dieser Arbeit etablierte Protokoll erlaubt eine schnelle und einfache Kultivierung der Keratinozyten sowie eine schnelle und effektive Reprogrammierung derselben zu humanen induzierten pluripotenten Stammzellen, wobei die Möglichkeit der direkten Reprogrammierung den zeitsparenden Aspekt auf die Spitze treibt. Diese massenhafte Probennahme und effektive Reprogrammierung würde die diagnostische wie auch therapeutische Forschung diverser Erkrankungen vorantreiben.

The main idea was to develop an easy to use sample platform for a sampling procedure with minimal invasiveness and time consumption to allow sampling in various different nations and settings. We furthermore wanted to find an easy way for sample transport with minimal negative effects on the samples. Additionally, we wanted to create the Super Keratinocyte Gel (SKG) reprogramming protocol by modifying the well established reprogramming protocol of Aasen and Belmonte 2010. In this cause we chose to use the Sendai virus as delivering vector system (Li et al. 2000). We wanted to optimize the SKG protocol in terms of time consumption and efficiacy.

To address the idea of the modified protocol, we collected hair samples and compared the classical protocol and the SKG prototype as platform for culturing keratinocytes. Next we tested freezing and thawing the loaded prototypes as a possible transportation and storage option. As we aimed to apply a protocol empowering almost anyone as sample aquisitor, we examined the effect of evaporation on the outgrowth rate of the hair during the loading on the prototype. As another time saving possibility, we tried to replate the prototypes with the loaded hair after the outgrowth of keratinocytes was achieved. Finally we compared feeder assisted and feeder free of the keratinocytes into hiPSC using our developed protocol regarding time consumption and efficacy. The main achievements of this study are: I) The establishment of the SKG system as a valid sampling platform for acquisition, transport and culture of keratinocytes. II) Further reduction of time and workload for generation of hiPSC by replating and reprogramming using the Sendai Virus and the optimized SKG protocol.

Altogether the SKG system is a great tool for non-invasive large scale sampling with very low requirements regarding material or personnel resources. The protocol established in this thesis allows quick and easy culturing of the keratinocytes as well as fast and effective reprogramming them into hiPSC, with the possibility of direct reprogramming pushing the time saving aspect to the peak. This large scale sampling and effective reprogramming would enhance diagnostic and therapeutic research of various diseases.