Assessing Endometrial SARS-CoV-2 Infection with 3D Spheroids and Organoids: Implications for Vertical Transmission

Abstract

Der globale Ausbruch von COVID-19, verursacht durch SARS-CoV-2, stellt eine beispiellose Herausforderung für die öffentliche Gesundheit dar. Eine Infektion mit SARS-CoV-2 während der Schwangerschaft wurde mit einem erhöhten Risiko für Früh- und Fehlgeburten in Verbindung gebracht, während die Möglichkeit einer intrauterinen Übertragung noch ungeklärt ist. Die Ziele dieser Arbeit sind die Bestätigung des Vorkommens der Eintrittsfaktoren für SARSCoV- 2 im Endometrium und die Untersuchung des Einflusses der Dezidualisierung auf deren Expression. Zudem soll ein neuartiges in vitro-Modell des Endometriums in Form von 3D-Sphäroiden etabliert werden, um die Anfälligkeit von Endometriumzellen für SARS-CoV-2 zu bestimmen und die pathophysiologischen Auswirkungen einer endometrialen SARS-CoV-2-Infektion auf molekularer Ebene zu evaluieren. Die Liquid-Overlay-Technik wurde verwendet, um 3D-Sphäroide des Endometriums aus humanen endometrialen Stromazellen und der Ishikawa-Zelllinie zu generieren. Endometriale Organoide, aus primären Stammzellen von Endometriumbiopsien, wurden kultiviert und mit den Sphäroiden verglichen. Die Dezidualisierung wurde mittels 8-Bromo-cAMP und Medroxyprogesteron induziert, um die in vivo-Bedingungen während der Schwangerschaft zu simulieren. Die Expression von Dezidualisierungsmarkern (PRL, IGFBP1 und HSD11B1) sowie SARS-CoV-2-Eintrittsfaktoren (ACE2 und TMPRSS2) wurde mittels qPCR und Western Blot analysiert. Infektionsexperimente mit einem rekombinanten Virusstamm, der mNeonGreen exprimiert, sowie mit authentischen SARS-CoV-2-Viren wurden durchgeführt. Mittels Zytokin-Assays und RNA-Sequenzierung wurde die Reaktion der Wirtszelle auf die virale Invasion untersucht. Unsere Studie zeigte die Anwesenheit von ACE2 und TMPRSS2 in Endometriumzellen sowie eine erhöhte Expression von ACE2 nach Dezidualisierung. Ein neues endometriales Sphäroidmodell wurde erfolgreich etabliert. Die Anfälligkeit für eine SARS-CoV-2-Infektion wurde nachgewiesen. Diese geht mit einer Entzündungsreaktion und Dysregulation von Genen einher, die mit der Immunantwort, hämatovaskulären und zellulären Funktionen assoziiert sind. Die Veränderungen in der Genexpression variierten zwischen nicht-dezidualisierten und dezidualisierten Sphäroiden und Gene, die mit dem angeborenen Immunsystem assoziiert sind (CCL20, CD38, LCN2 und NR4A3), waren dysreguliert. Dies ist ein potenzieller Mechanismus für die Immunevasion von SARS-CoV-2. Diese Ergebnisse liefern bedeutende Erkenntnisse zur Möglichkeit der vertikalen Übertragung von SARS-CoV-2 während der Schwangerschaft und erfüllen somit die anfänglich definierten Ziele. Endometriale Sphäroide stellen ein innovatives Modell für die Erforschung viraler Interaktionen dar und sollten in Studien mit bekannten vertikal übertragbaren Erregern weiter validiert werden. Das Verständnis dieser molekularen Mechanismen ist von zentraler Bedeutung für die Entwicklung präventiver und therapeutischer Interventionen für schwangere Patientinnen mit COVID-19.

The global outbreak of COVID-19 caused by SARS-CoV-2 has posed unprecedented challenges to public health. SARS-CoV-2 infection during pregnancy has been associated with an elevated risk of preterm birth and miscarriage, while the potential for intrauterine transmission remains uncertain. The primary objectives of this thesis are to confirm the presence of key SARS-CoV- 2 entry factors in the endometrium and to investigate the impact of decidualization on their expression. Further, it seeks to establish 3D spheroids as a novel in vitro model of the endometrium to determine the susceptibility of endometrial cells to SARS-CoV-2 and to assess the endometrial pathophysiology of SARS-CoV-2 infection on a molecular level. The liquid-overlay technique was employed to establish 3D endometrial spheroids using human endometrial stromal cells and the Ishikawa cell line. Endometrial organoids, derived from primary stem cells of endometrial biopsies, were cultured and compared to the spheroids. Decidualization was induced with 8-bromo-cAMP and medroxyprogesterone to mimic in vivo conditions during pregnancy. The expression of decidualization markers (PRL, IGFBP1 and HSD11B1) as well as SARS-CoV-2 entry factors (ACE2 and TMPRSS2) were assessed with qPCR and western blotting. Infection experiments involving a recombinant virus strand expressing mNeonGreen and authentic SARS-CoV-2 were conducted, followed by cytokine assays and RNA sequencing to evaluate the host response to viral invasion. Our study revealed the presence of ACE2 and TMPRSS2 in endometrial cells as well as an increased expression of the former following decidualization. A novel endometrial spheroid model was successfully established. Susceptibility to SARS-CoV-2 infection was demonstrated with ensuing inflammation and dysregulation of genes associated with immune response, hematovascular and cellular functions. Changes in gene expression varied between nondecidualized and decidualized spheroids and genes associated with the innate immune system (CCL20, CD38, LCN2 and NR4A3) were dysregulated, constituting a potential mechanism for immune evasion of SARS-CoV-2. These findings offer valuable insights into the possibility of vertical transmission of SARS-CoV-2 during pregnancy, closely aligning with the originally defined objectives. The endometrial spheroids provide a novel platform for studying viral interactions, which require further validation in studies using pathogens with known vertical transmission. Understanding the molecular mechanisms involved holds implications for the development of preventive and therapeutic interventions for pregnant patients with COVID-19.