Detection of immunogenic cell death after oncolytic virotherapy of glioblastomas

Abstract

Das Glioblastom (GBM) ist der häufigste primäre maligne Hirntumor des Erwachsenen. Gekennzeichnet durch hochaggressives, infiltratives Wachstum, geht es mit einem obligat letalem Verlauf bei einem medianen Überleben von weniger als 20 Monaten einher. Die Onkovirotherapie (OVT) ist ein therapeutischer Ansatz, bei dem GBM-Patienten onkolytische Viren (OV) verabreicht werden, die sich selektiv in neoplastischen Zellen replizieren und diese bei Freisetzung des Virus lysieren. Von besonderem Interesse ist dabei die Induktion des immunogenen Zelltodes (ICD), der maßgeblich durch die Freisetzung und Präsentation bestimmter Alarmsignale, sog. DAMPs, vermittelt wird. Da das patienteneigene Immunsystem dadurch den Primärtumor, aber insbesondere auch infiltrativ wachsende, nicht direkt vom Virus erreichbare Tumorzellen nachhaltig angreifen kann, ist die klinische Relevanz des ICD enorm.

In dieser Arbeit sollte die Induktion von ICD im GBM durch das onkolytische Adenovirus XVir-N-31 untersucht werden. Da sich Adenoviren nur in humanen, nicht aber in murinen Zellen replizieren, wurden immundefiziente NSG™-Mäuse mit einem Tumorzell-HLA-gematchten humanen Immunsystem ausgestattet und in beide Striata humane GBM Zellen appliziert, die im Gehirn zum GBM heranwachsen. Nach Tumorgeneration erfolgte in den rechtsseitigen Tumor eine intratumorale Injektion von PBS (Scheinbehandlung), XVir-N-31, XVir-N-31-anti-PD-L1 (sezerniert einen PD-L1 antagonisierenden Antikörper) oder dl309 (Ad-Wildtyp Derivat), während der kontralateral lokalisierte Tumor unbehandelt blieb. Alle Mäuse wurden beim Auftreten von Tumor-assoziierten Symptomen in der ersten Maus kollektiv geopfert. Die detaillierte Behandlung wurde in Klawitter et al. (2022) veröffentlicht. Mittels Immunofluoreszenz wurde ICD durch den Nachweis von DAMPs im Tumor und im umliegenden Gewebe identifiziert.

Nach OVT des GBM mit XVir-N-31 waren bedeutende DAMPs (HMGB1 und HSP70) detektierbar, die nach Injektion von Ad-WT (dl309) nicht nachweisbar waren. Spezifisch XVir-N-31 induziert demnach einen ICD, ein Effekt, der durch die Kombination der OVT mit Immun-Checkpoint-Inhibitoren wie z.B. Nivolumab noch verstärkt wurde. ICD wurde ebenfalls induziert, wenn das OV mittels intranasaler Applikation OV-beladener Shuttle-Zellen zum Tumor transportiert wurde. Zusammenfassend liefern unsere Ergebnisse den prinzipiellen Nachweis, dass XVir-N-31 ein potenter Induktor des ICD ist, zumindest in den hier verwendeten Maus-GBM Modellen. Dies ist eine wesentliche Erkenntnis für die zukünftige erfolgreiche klinische Anwendung von XVir-N-31, vor allem in Kombination mit weiteren Immun-induzierenden Therapieansätzen.

Glioblastoma (GBM) is the most common primary malignant brain tumour in adults. With a median survival time of less than 20 months, it remains incurable, mostly due to its highly aggressive, infiltrative growth. Oncolytic virotherapy (OVT) is an approach to cancer treatment in which patients receive oncolytic viruses (OVs) that selectively replicate in and lyse neoplastic cells. Of particular interest is the induction of immunogenic cell death (ICD), mediated mainly by the release and presentation of DAMPs. ICD can contribute to a long lasting anti-tumour response, allowing the patient's immune system to attack not only the main tumour but also infiltrating GBM cells that were not directly infected and killed by intratumourally applied OVs. Thus, the clinical relevance of ICD induction is enormous.

The aim of this thesis was to test whether the OAV XVir-N-31 induces ICD in GBM. Since adenoviruses replicate in human, but not in murine cells, immuno-deficient NSG™ mice were equipped with a to the tumour HLA-A/B-matched humanised immune system and inoculated with human GBM cells in both striata. The right sided rapidly developing GBM was then intratumourally injected with either PBS (sham treatment), XVir-N-31, XVir-N-31-anti-PD-L1 (secreting a PD-L1 binding antagonistic antibody) or dl309 (an Ad-Wildtype derivate), while the contralaterally located tumour was left untreated. All mice were sacrificed collectively at the onset of tumour associated symptoms in the first mouse of any group. The detailed treatment has been published in Klawitter et al. (2022). Immunofluorescence was used to identify ICD by the detection of DAMPs in the tumour and surrounding tissue.

We identified key DAMPs such as HMGB1 and HSP70 in the tumour tissue after OVT with XVir-N-31 that were absent after virotherapy using dl309, suggesting that XVir-N-31 specifically induces ICD. In following experiments, we observed that the combination of XVir-N-31 with an ICI such as nivolumab enhances this effect. Furthermore, XVir-N-31 delivered to GBM by the intranasal application of XVir-N-31 loaded shuttle cells also induced ICD in the tumour. In conclusion, our data show that XVir-N-31 is a potent inducer of ICD, at least in our mouse models of GBM. This is a prerequisite for a successful clinical application of XVir-N-31 in GBM patients in the future.