Inhaltszusammenfassung:
In der vorliegenden Arbeit sollte im Mausmodell die Infektion mit Trypanosoma brucei brucei (Tbb) näher untersucht werden, um Erkenntnisse über Proliferationsverhalten und morphologische Veränderungen von MG im Rahmen dieser Infektion zu erhalten und um so ein besseres Verständnis für mikrogliales Verhalten im zeitlichen Verlauf von pathologischen Prozessen zu bekommen. Dies sollte nicht qualitativ, sondern insbesondere quantitativ erfolgen, da quantitative Analysen der morphologischen Veränderung von MG insbesondere im Rahmen der Humanen Afrikanischen Trypanosomiasis (HAT) bisher wenig erfolgten bzw. veröffentlicht wurden. Verwendet wurde hierfür ZNS-Gewebe aus einem anderen Projekt. Dieses Gewebe stammt von 30 weiblichen C57BL/6-Mäusen, die in sechs Fünfergruppen aufgeteilt worden waren. Je nach Gruppenzuteilung, erhielten die Tiere eine intraperitoneale Injektion, entweder mit PBS (Kontrollgruppen) oder einer Parasitensuspension, die den Parasiten Tbb (Stamm: GVR 35 m-Cherry) enthielt. Die Tiere wurden 10, 20 oder 30 Tagen nach der Injektion eingeschläfert, das Gewebe entnommen, fixiert und bis zur weiteren Prozessierung bei -80°C gelagert. Das Gewebe wurde dann immunhistochemisch mit den weitestgehend makrophagen- bzw. mikrogliaspezifischen primären Antikörpern anti-iba-1 bzw. anti-TMEM119 sowie weiteren sekundären Antikörpern markiert. Anschließend wurden mittels Zweiphotonenmikroskopie Bilderstapel (als Annäherung an eine drei-dimensionale Aufnahme) der Gehirnareale LPA, PVR und Cortex unterschiedlicher Gesamtvergrößerung und Auflösung (abhängig von der Fragestellung) aufgenommen. Mittels Fiji-Software und Imaris Bitplane-Software wurden die Aufnahmen bearbeitet und dann ausgewertet. Zunächst wurde versucht, die Frage nach dem Proliferationsverhalten zu klären. Hierfür wurden mikrogliale (MG) Zell- und Dupletdichte in den Arealen lateral preoptic area (LPA), periventrikuläre Region (PVR) und Cortex bestimmt, die den Erwartungen entsprechend im Infektionsverlauf anstiegen. Um auszu-schließen, dass der Zuwachs an Zellen einer Immigration peripherer Immunzellen entspricht, wurde zusammen mit der Arbeit von Speidel (2020) der Anteil anti-TMEM119+/anti-iba-1+-Zellen bestimmt. Es zeigte sich (unter der Annahme, dass TMEM119 ein zuverlässiger mikrogliaspezifischer Marker ist), dass der Anteil peripherer Immunzellen erst nach 30dpi erwähnenswert ausfällt, dafür aber dann abhängig vom Areal zwischen 37% und 54% ausmachen kann. Entsprechend lässt sich festhalten, dass nach 10dpi und 20dpi eher keine peripheren Zellen die Zell- und Dupletdichte verfälscht haben. Da davon auszugehen ist, dass auch nach 30dpi eine relevante Proliferation stattgefunden hat, wurde die Zelldichte um den immigrierten Anteil bereinigt erneut dargestellt, was die These der anhaltenden Proliferation stützt. Als nächstes fand die Analyse der mikroglialen Morphologie statt. Hierfür wurden nur kortikale MG aufgenommen und mittels Imaris Bitplane dreidimensional rekonstruiert. Da methodisch bedingt die aufgenommen Bilderstapel lediglich eine Dicke von 25μm abdeckten, insbesondere ramified MG aber auch mit deutlich größeren Durchmessern des von ihnen überwachten Volumens beschrieben sind, sind die in dieser Arbeit bestimmten Größenordnungen allerdings eher relativ als absolut zu sehen. Dennoch führten sie zu aussagekräftigen und vergleichbaren Ergebnissen, da alle Zellen stets mittig aufgenommen wurden und die beschriebenen morphologischen Veränderungen damit eher noch signifikanter im Vergleich zu den Kontrollgruppen ausgefallen wären, da entsprechend v. a. die Fortsätze der ramified MG der Kontrollgruppen entsprechend stärker ‚be-schnitten‘ wurden. Für die Rekonstruktionen wurden die Somata und die Fortsätze der MG jeweils mit einem eigenen Algorithmus in Imaris Bitplane rekonstruiert und verschiedene Parameter der Rekonstruktionen aus der Software exportiert. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass bereits nach 10dpi signifikante Veränderungen der Somata und der Fortsätze auftreten. Dies umfasst insbesondere vergrößerte und entrundete Somata und verkürzte, weniger verzweigte Fortsätze bis hin zur teils völlig amöboiden Morphologie im Fortschreiten des Infektionsverlaufs. Dies ist deshalb besonders interessant, da kortikale MG auch in der meningoenzephalitischen Phase erst sehr spät direkten Erregerkontakt haben, diese aber (zumindest im Rahmen der vorliegenden Arbeit) ihre Morphologie dennoch schon sehr früh angefangen haben, zu verändern. Zwar wurden Erreger in dieser Arbeit nie direkt nachgewiesen, dennoch kann man anhand der vorangegangenen Schilderungen vermuten, dass nach 10dpi und 20dpi keine direkten Erreger-MG-Interaktionen stattfanden und damit die morphologischen und proliferativen Veränderungen am ehesten als Reaktion auf Botenstoffe aus dem Blut (a. e. Chemo- und Zytokine) zu interpretieren wären. Abschließend lässt sich also zusammenfassen, dass die MG schon frühzeitig beginnen, zu proliferieren und auch eine immer mehr reaktiv wirkende Morphologie zeigen; auch wenn sie vermutlich eher noch keinen direkten Kontakt zum Erreger selbst hatten. Inwiefern diese morphologischen Veränderungen zur Symptomatik der HAT beitragen oder diese die Symptomatik eher in Zaum halten, lässt sich anhand dieser Untersuchungsergebnisse nicht sagen. Es lässt sich aber festhalten, dass die verwendeten Methoden zur Quantifizierung der Zelldichte, des Anteils der aus der Peripherie immigrierten Immunzellen und der Morphologie sehr gut geeignet sind, um diese zu bestimmen und zu beschreiben. Prinzipiell sollte es auch möglich sein, diese Methoden auf andere Fragestellungen, beispielsweise im Rahmen anderer Pathomechanismen, zu übertragen. Auch die Methode zur Bestimmung der Dupletdichte könnte, sofern es sinnvoll erscheint und mit weiteren Methoden kombiniert wird, im Rahmen anderer Fra-gestellungen angewandt werden, allerdings gibt es zur Untersuchung von Proliferation auch sehr gute in vivo Imagingmethoden, die ggf. eindeutigere Ergebnisse liefern könnten. In dieser Arbeit sind die Ergebnisse der Dupletdichte erst nach 30dpi signifikant, wobei hier auch der Anteil immigrierter Immunzellen sehr hoch ist und eine Interpretation entsprechend erschwert ist. Bezüglich der Forschung an Tb ssp. könnten weitere Ergebnisse mittels in vivo Imaging, Flow Cytometry und PCR weitere Informationen über ZNS-Invasion in-klusive Überwinden der ZNS-Barrieren, Proliferation der MG, morphologische Veränderungen der MG, parasitäre Distribution während des ZNS-Befalls und letztendlich auch zur HAT-Diagnostik und -Therapie beitragen.
