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Pseudomonas aeruginosa (Pa) ist ein Gram-negatives Bakterium, welches vor allem nosokomiale Infektionen wie Pneumonie oder Sepsis verursacht. Ebenso bei Patienten mit Zystischer Fibrose kann die Besiedlung mit Pa ein lebensbedrohliches Problem darstellen. Weiterhin wird durch die ansteigende Anzahl von Resistenz gegen viele Antibiotika die therapeutische Behandlung einer Pa Infektion immer problematischer. Daher werden dringend neue Therapieansätze benötigt. Um solche Therapieansätze zu entwickeln, ist das Verstehen von Resistenzmechanismen sehr wichtig. Bei dem Pa Stamm ID40 handelt es sich um einen Stamm, der multi-resistent gegen β-Laktamantibiotika ist. Durch eine Punktmutation in dem dacB Gen kommt es bei diesem Stamm zu einer Hyperproduktion der β-Laktamase AmpC. In einer vorhergehenden Studie wurde untersucht, welche Gene ursächlich die β-Laktamresistenz von ID40 beeinflussen. Hierbei wurden vor allem Gene identifiziert, die einen Einfluss auf das Peptidoglykanrecycling haben. Weiterhin wurde das uncharakterisierte Gen ygfB identifiziert. Die Deletion von ygfB in ID40 führt zu einer Reduktion der ampC Expression, der β-Laktamase Aktivität und konsequenterweise zu einer reduzierten Resistenz gegen verschiedene β-Laktam Antibiotika.
In der vorliegenden Arbeit sollte nun untersucht werden, wie YgfB zu einer erhöhten ampC Expression beiträgt. Mithilfe von RNA-Seq Transkriptomanalysen und quantitativer Reverse Transkriptase-qPCR konnte durch den Vergleich von Pa ID40 WT mit einer ygfB Deletionsmutante gezeigt werden, dass YgfB die Transkription der Amidase ampDh3 signifikant reprimiert und die Expression der β-Laktamase ampC erhöht wird. Weiterhin konnte eine leichte Hemmung des sogenannten alpBCDE Operons festgestellt werden. Durch zusätzliche Deletion von ampDh3 in der ygfB Deletionsmutante konnte ein kausaler Zusammenhang zwischen YgfB-vermittelter Hemmung der ampDh3 Expression und YgfB-vermittelter Erhöhung der ampC Expression hergestellt werden. Orthologe YgfB Proteine kommen in vielen γ-Proteobakterien mit unterschiedlicher hoher Aminosäuresequenzidentität vor. So ist die Aminosäuresequenzidentität mit YgfB von E. coli mit 32.5% und mit A. baumannii 18%. Mit Hilfe von Komplementierungsexperimenten konnte gezeigt werden, dass die Homologie von E. coli YgfB aber nicht von A. baumannii YgfB ausreichend ist das Pa YgfB für die Repression der ampDh3 Expression und Erhöhung der β-Lactamase Aktivität, zu ersetzen.
AmpDh3 ist eine Amidase, die von Peptidoglykanfragmenten den Peptidstamm abspaltet. Dies hat wie in nachfolgenden Studien gezeigt wurde zur Folge, dass durch AmpDh3 bestimmte Muropeptide (1,6-anhydro-N-Acetylmuramyl-peptide) gespalten werden, die den die ampC-Expression induzierenden Transkriptionsfaktor AmpR positiv regulieren. YgfB dagegen inhibiert die AmpDh3 Produktion und verringert dadurch die Spaltung dieser Muropeptide, was zu einer verstärkten AmpR-induzierten ampC Expression führt.
ampDh3 Promotoranalysen zeigten, dass YgfB die ampDh3 Expression auf transkriptioneller Ebene hemmt. Es konnte grob die Region im ampDh3 Promotor definiert werden, die benötigt wird, damit YgfB die ampDh3 Transaktivierung inhibieren kann.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass in der vorliegenden Studie zum allerersten Mal dem Protein YgfB eine Funktion, nämlich die der negativen Regulation der ampDh3 mRNA Expression, zugeordnet werden konnte. Weiterhin stellte diese Studie die Basis für weitere Studien dar. Diese weiterführenden Studien und die Erkenntnisse von Pena et al. führten letztendlich zur Aufklärung eines komplexen Signalwegs: ampDh3 Expression wird durch den Antiterminator AlpA positiv reguliert. AlpA bindet an die AlpA-Binde-Stelle (ABS), welche identisch ist mit der Stelle die in der vorliegenden Arbeit als der Bereich identifiziert wurde, der zur YgfB vermittelten Repression der ampDh3 Promotoraktivität führt. Eine erhöhte AmpDh3 Produktion führt zum verstärkten Abbau von AnhydMurNAc-Peptiden und somit zu einer reduzierten ampC Expression bzw. β-Laktamase Aktivität und nachfolgender geringerer Resistenz gegenüber β-Laktamantibiotika. YgfB wirkt diesem Prozess entgegen, in dem es direkt an AlpA bindet und so die Bindung von AlpA an das ABE verhindert und letztendlich die ampDh3 Expression reprimiert. Die Repression der ampDh3 Expression trägt dann letztendlich zur erhöhten β-Laktamresistenz bei. |
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