Veränderungen von Expressionsmerkmalen in Blasentumor-Organoiden während Langzeitkultivierungen

Abstract

In dieser Promotionsarbeit, welche in Kooperation mit dem Graduiertenkolleg 2543 entstanden ist, ging es um die Fragestellung, inwiefern Organoide ein valides Forschungsmodell hinsichtlich ihrer Anzuchterfolge und der Vergleichbarkeit mit dem Originaltumor nach Passagierung darstellen. Dafür wurde aus intraoperativ gewonnen Gewebeproben von Urothelkarzinomen 3-D Zellkulturen angelegt. Es wird postuliert, dass bei dieser Methode die physiologischen in vivo Wachstumsbedingungen eher imitiert werden, als es bei der traditionellen 2-D Variante der Fall wäre. Auf diese Weise entstandene Organoide könnten den Merkmalen des Originaltumors ähnlicher und somit vergleichbarer sein. Die Zellkulturen wurden über mehrere Passagen kultiviert, aufgearbeitet, und in verschiedenen Stadien histologisch mittels Immunfluoreszenz und Immunhistochemie untersucht. Dafür wurden verschiedene Zellstrukturen als Marker verwendet, deren Expression in Korrelation mit klinisch relevanten Subtypen des Urothelkarzinoms stehen. Speziell geht es um die Zytokeratine CK5, CK7, CK20, die Transkriptionsfaktoren GATA3, TP53, TP63, und den Oberflächenrezeptor FGFR3. Von 49 Gewebeproben konnten 5 die von uns per Definition auf die 5. Passage festgelegte Grenze, um als Organoidkultur zu gelten, erreichen. Dies ist eine Erfolgsrate von rund 10%. Für frühe, sogenannte Spheroide konnten 14 erfolgreich über die 2. bis zur 5. Passage kultiviert werden, eine Erfolgsrate von 29 %. Damit konnten wir die Erfolge anderer Arbeitsgruppen wie 70% für Organoide ≥ 6. Passage bei Lee et al (2018) oder 50% bei Mullender et al (2019) nicht reproduzieren. Kombiniert mit dem Zeit- und Materialaufwand dieser Methode müssen für zeitnahe klinische Fragestellungen weitere Mühen für eine erfolgreichere und verlässliche Anzucht investiert werden. Zwar sind die Anzuchtraten für frühe, Spheroide größer, allerdings kann hier bisher kein Fortbestand der Zellkultur garantiert werden. Des Weiteren ist es in diesem Stadium schwierig, genug Material für eine aussagekräftige Färbereihe, sowie potenzielle DNA-Analysen und Weiterkultivierung zu erlangen. Wurde eine Probe erfolgreich als Organoid-linie etabliert tendierte diese zu einem quantitativ verlässlichen und vorhersagbaren Wachstum. Dies garantiert genug Material zum Weiterführen der Kultur über viele Passagen, sowie extensive Untersuchungen mittels DNA-Analyse und IHC oder IFL – Färbungen. Bis zu diesem Punkt war in dieser Arbeit ein Zeitraum von mindestens einem Monat nötig. Hinsichtlich des Expressionsverhaltens ausgesuchter Zellstrukturen über die Zeit ist zu erkennen, dass es in höheren Passagen bis auf CK7 zu einer mehr oder weniger starken Änderung der Expressionshäufigkeit der hier interessanten Marker kommt. Die Markerexpression verringerte sich und zeigte eine Tendenz weg vom luminalen und hin zum basalen Subtyp, was sich mit den Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen deckt. Dies stellt einen wichtigen Punkt in der Vergleichbarkeit mit dem Originalgewebe dar. Die Mechanismen hinter diesem Verhalten, z.B. dem Einfluss des tumor micoenvironment, müssen tiefergehend studiert werden, um valide Vorhersagen treffen zu können.