Oncolytic Virotherapy of Neuroendocrine Neoplasms with the Vaccinia virus GLV-1h68 and the Herpes simplex virus T-VEC

Abstract

Metastasierte neuroendokrine Neoplasien, worunter neuroendokrine Tumore und neuroendokrine Karzinome zählen, sind immer noch tödliche Erkrankungen und erfordern dringend neuartige erfolgversprechende Therapiemöglichkeiten. Zur onkolytischen Virotherapie werden Viren so selektiert oder genetisch verändert, dass sie spezifisch in Tumorzellen replizieren. Durch Infektion, Replikation und Freisetzung von neuen Viren breiten sich onkolytische Viren im Tumorgewebe aus und lysieren die Zellen des Tumors. Dabei erzeugen sie ein entzündliches Milieu im Tumor, welches Immunzellen anlockt und das Immunsystem des Patienten zur systemischen Tumorbekämpfung anregt. Das Ziel dieser Dissertation war es, den Einsatz der onkolytischen Virotherapie für neuroendokrine Neoplasien zu evaluieren. Zwei onkolytische Viren, welche beide bereits in klinischen Studien im Patienten eingesetzt wurden, wurden zur weiteren Erprobung in Zelllinien neuroendokriner Neoplasien eingesetzt. Bei GLV-1h68 handelt es sich um ein onkolytisches Vaccinia Virus, das aktuell in klinischen Phase I/II Studien zur Therapie anderer Tumorentitäten getestet wird. Das zweite onkolytische Virus T-VEC gehört der Klasse der Herpes Simplex Viren an und ist bereits für die Therapie des fortgeschrittenen Melanoms klinisch zugelassen. Sechs Zelllinien wurden in dieser Studie untersucht. Davon stammen je zwei aus neuroendokrinen Tumoren des Pankreas, zwei aus neuroendokrinen Tumoren der Lunge und zwei aus neuroendokrinen Karzinomen. Der Einfluss beider Viren auf die Zellviabilität wurde mittels SRB Viabilitätsassay bestimmt und die Veränderung dieser über die Zeit wurde durch Echtzeit Zellanalyseverfahren untersucht. Im Weiteren wurden die Virusreplikation quantifiziert, mikroskopische Bilder der infizierten Zellen angefertigt sowie die zelluläre Transgenexpression beider Viren gemessen. Darüber hinaus wurden durch elektronenmikroskopische Bilder der Prozess der Virusumhüllung sowie der Zellaustritt von T-VEC visualisiert. Zusätzlich wurde mit denselben Methoden eine Kombinationstherapie mit dem für diese Indikation eingesetzten Medikament Everolimus und beiden onkolytischen Viren evaluiert. Außerdem wurde die Wirkung von Ganciclovir auf die T-VEC Behandlung von neuroendokrinen Tumorzellen beurteilt. Es konnte gezeigt werden, dass beide Viren Tumorzellen infizieren, darin replizieren und diese Zeit- und Dosisabhängig zerstören. Hierbei wurden nur sehr niedrige Konzentrationen von T-VEC benötigt, welches sich hierdurch als besonders vielversprechende zukünftige Therapie für neuroendokrine Neoplasien auszeichnete. Mittels Transmissionselektronenmikroskopie konnten das T-VEC Virion sowie die zellulären Veränderungen von neuroendokrinen Tumorzellen nach Infektion mit T-VEC visualisiert werden. Darüber hinaus konnte eine starke Transgenexpression beider Viren nachgewiesen werden. Die Kombinationstherapie beider Viren mit Everolimus erwies sich nur als minimal der Monotherapie überlegen. Ganciclovir zeigte sich als potentes Virostatikum, indem es effektiv die Replikation von T-VEC einschränkte. Zusammenfassend konnte in vitro gezeigt werden, dass die onkolytische Virotherapie eine vielversprechende Therapiemöglichkeit für neuroendokrine Neoplasien darstellt. Sowohl GLV-1h68 als auch T-VEC demonstrierten hohe onkolytische Aktivität in Zell- linien eines breiten Spektrums neuroendokriner Neoplasien. Insbesondere T-VEC empfiehlt sich für eine weitere präklinische und klinische Entwicklung, da bemerkenswert niedrige Viruskonzentrationen für eine effektive Replikation und Toxizität in Tumorzellen ausreichten. Die Bedeutung der Kombinationstherapie mit Everolimus bleibt unklar. Ganciclovir konnte als wichtiges Virostatikum für T-VEC etabliert werden, um Sicherheitsbedenken bei der Therapie mit diesem replikationskompetenten Virus zu vermeiden.

Metastatic neuroendocrine neoplasms, including neuroendocrine tumors and neuroendocrine carcinomas, are still a fatal disease and are in desperate need for novel promising therapy options. For oncolytic virotherapy, viruses are genetically engineered or selected to specifically replicate in tumor cells. By infecting, replicating and releasing viral progeny, oncolytic viruses spread infectiously through the tumor tissue and lyse tumor cells. Simultaneously, an inflammatory environment is created within the tumor, attracting immune cells and mobilizing the patient’s immune system to perform a widespread systemic antitumor immune response. This study aimed to evaluate oncolytic virotherapy for neuroendocrine neoplasms. Two oncolytic viruses, which have both already been administered to patients in clinical trials, were selected to be studied for their activity in six cell lines derived from neuroendocrine neoplasms. GLV-1h68 is an oncolytic vaccinia virus currently being tested in clinical phase I/II trials for several other cancer entities. The second virus is the herpes simplex virus T-VEC, being already clinically approved for treatment of advanced melanoma. Six cell lines, two of them originating from pancreatic neuroendocrine tumors, two derived from neuroendocrine tumors of the lung and two originating from neuroendocrine carcinomas were employed in this study. The impact of both viruses on cell viability was measured using SRB viability assays and the development of cell viability over time was studied using real-time cell monitoring. Further, virus replication was quantified, microscopic pictures of the infected cell layer were taken and transgene expression of both viruses was assessed. Additionally, transmission electron microscopic pictures were taken to visualize T-VEC envelopment and cell egress. For both viruses, a combinatorial regimen using Everolimus, a state-of-the-art treatment for neuroendocrine tumors, was evaluated employing the same methods. Moreover, the effect of Ganciclovir on T-VEC treatment of cells from neuroendocrine neoplasms was studied. Both viruses were shown to infect, replicate in and kill tumor cells in a time and dose dependent manner. T-VEC required outstandingly low concentrations, thereby characterizing itself as a particularly promising drug candidate for neuroendocrine neoplasms. Via electron microscopy, the T-VEC virions as well as the cellular responses of neuroendocrine tumor cells to virus infection could be visualized. Transgene expression was found to be strong with both viral agents. The combinatorial treatment with Everolimus was only found to be slightly superior to monotherapy. The potency of Ganciclovir as a virostatic drug for T-VEC could be proven, efficiently limiting T-VEC replication. In summary, oncolytic virotherapy was found to be a promising therapy for neuroendocrine neoplasms in vitro. Both, GLV-1h68 and T-VEC, were shown to have high oncolytic activity in a broad spectrum of cell lines originating from neuroendocrine neoplasms. T-VEC especially demands for further preclinical and clinical development, only requiring strikingly low concentrations to replicate in and kill tumor cells. The future role of a combinatorial treatment with Everolimus remains unclear, yet still being a considerable treatment option. Ganciclovir was shown to be an important safety feature in T-VEC mediated virotherapy, preventing safety concerns using a replication competent viral vector.