Differenzierung von osteogenen Vorläuferzellen aus induzierten pluripotenten Stammzellen

Abstract

In der MKGC sind große Knochendefekte noch immer eine Herausforderung und eine Limitation für den Einsatz von Knochenersatzmaterialien. Das Knochen-Tissue Engineering (BTE) versucht diese Limitierungen zu durchbrechen und zukünftig Alternativen zum autologen Knochentransplantat zu entwickeln. Hierfür werden große Mengen autologer mesenchymaler Stammzellen (MSCs) benötigt, was in vielen Fällen ein Problem darstellt, da die Vervielfältigung der Zellen in vitro durch die Abnahme des osteogenen Potentials mit steigender Passage limitiert ist. Qualität und Quantität der verwendbaren Zellen variiert zudem stark zwischen verschiedenen Patienten und ist nicht zuletzt vom Gesundheitszustand und dem Alter des Patienten sowie der Entnahmestelle abhängig. Diese Limitierungen könnten durch die Verwendung von iMSCs als alternative Stammzellquelle überwunden werden. Diese werden durch die Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) zu MSC-ähnliche Zellen hergestellt. iPSCs sind fähig sich selbst zu erneuern, in vitro unbegrenzt zu proliferieren und theoretisch in jedes Gewebe zu differenzieren. Durch die unlimitierte Verfügbarkeit der iPSCs, können auch große Mengen von iMSCs hergestellt werden. Jedoch zeigten die, in vorangegangenen Arbeiten hergestellten, iMSCs bislang eine niedrige Differenzierungseffizienz und frühe Anzeichen von Seneszenz. In dieser Arbeit sollte daher für die Herstellung der iMSCs eine neue Methode entwickelt und getestet werden. Hierbei sollten die folgenden Fragestellungen beantwortet werden. 1. Kann die Effizienz der iMSC-Differenzierung durch schonenderes Ausplattieren verbessert werden? 2. Kann die Effizienz der iMSC-Differenzierung durch die Zugabe des TGF-β-Inhibitors SB431542 verbessert werden? 3. Wie lange müssen die iMSCs differenziert werden, um als osteogene Vorläuferzellen eingesetzt werden zu können? 4. Bewirkt eine Verbesserung der Differenzierungseffizienz eine Reduktion der Expression von Seneszenzmarkern? Zur Untersuchung der Differenzierung wurden iPSCs über 4 Passagen hinweg zu iMSCs differenziert und dabei nach jeder Passage die Expression von MSC- und iPSC-Markern mittels Durchflusszytometrie und qPCR analysiert. Zudem wurde ab Passage 1 nach jeder Passage das osteogene Potenzial der Zellen durch die osteogene Stimulation und Analyse der Mineralisierung, sowie die Expression von Seneszenzmarkern mittels Durchflusszytometrie und qPCR analysiert. Durch die schonendere Initiierung der Differenzierung durch mechanisches Ablösen der iPSCs, konnte eine verbesserte Adhäsion, ein geringeres Absterben und eine frühere Differenzierung der Zellen beobachtet werden. Die Messung der CD105+ Zellen am Ende von P0 ermöglichte die Regulierung der Zelldichte in P1, welche ein kritischer Faktor für das Gelingen der Differenzierung ist. Die in früheren Versuchen beobachtete Seneszenz von iMSCs konnte durch die neue Differenzierungsmethode ebenfalls deutlich verringert werden. Die Analyse der SA-β-Gal Expression und der Expression der mit Seneszenz-assoziierten Gene P16INK4a und P21CIP1 der iMSCs in P3 zeigten eine niedrigere Expression gegenüber den iMSCs aus vorherigen Versuchen, sowie ein ähnliches Expressionslevel wie die JPCs. Durch die Zugabe des TGF-β-Inhibitors SB431542 verstärkte sich dieser Effekt. Der Verlauf der Oberflächenmarker- und Genexpression während der Differenzierung zeigte, dass eine Verlängerung der Differenzierungsdauer über P2 hinaus die Herunterregulierung von iPSC-Markern und die Hochregulierung von MSC-Markern nicht weiter verbesserte. Durch die Zugabe des TGF-β-Inhibitors SB431542 in Passage 0, zeigten die Zellen mikroskopisch früher eine MSC-ähnliche Morphologie als die Zellen ohne SB. Jedoch zeigten die Zellkulturen mit SB ab Tag 5 ein erhöhtes Zellsterben der sich differenzierenden und bereits differenzierten Zellen, was auf eine toxische Wirkung des TGF-β-Inhibitors hindeutet. Dadurch ergaben sich, trotz der anfänglich beschleunigten Differenzierung, in späteren Passagen keine positiven Auswirkungen auf die Markerexpression. Obwohl eine Verlängerung der Differenzierung über Passage 2 hinaus keine Verbesserung hinsichtlich der Markerexpression bewirkte, zeigte die Analyse der osteogenen Differenzierung eine spätere Ausreifung des osteogenen Potenzials. Sowohl Zellen ohne als auch mit SB zeigten mit steigender Passage einen deutlichen Anstieg der Mineralisierung. Erstaunlicherweise zeigten dabei mit SB kultivierte Zellen eine deutliche Verbesserung gegenüber Zellen, die ohne SB kultiviert wurden. Daraus ergibt sich der Schluss, dass SB431542 die Reifung des osteogenen Potenzials in den iMSCs beschleunigte. In der vorliegenden Arbeit konnte somit ein Protokoll etabliert werden, welches die zuverlässige Herstellung großer Mengen von qualitativ hochwertigen iMSCs erlaubt. Die Verwendung des TGF-β-Inhibitors führte zu einer früheren Ausprägung des osteogenen Potenzials und gleichzeitig zu einer Reduktion der Expression von Seneszenzmarkern.