Die Bedeutung der Proteine BamC, HlpA, DsbB, DsbH und DsbA1 für die Integrität der Außenmembran von Pseudomonas aeruginosa

Abstract

Pseudomonas aeruginosa (Pa), ein gramnegatives, stabförmiges Bakterium, ist ein opportunistischer Krankheitserreger, dessen Behandlung die Medizin vor große Herausforderungen stellt. Die meist nosokomial erworbenen Infektionen mit Pa betreffen vor allem immunsupprimierte Patienten und führen nicht selten zum Tod. Die Behandlung mit Antibiotika wird durch multiple intrinsische und erworbene Resistenzen der Bakterien zunehmend schwerer. Um Pa auch in Zukunft effizient bekämpfen zu können, müssen neue AB entwickelt werden. Dabei spielt die Suche nach potentiellen Angriffszielen für neue Wirkstoffe eine wichtige Rolle. In dieser Arbeit wurden die Proteine BamC, HlpA, DsbB, DsbH und DsbA1 auf ihrer Eignung als mögliche Targets genauer untersucht. Dazu wurden, basierend auf dem Laborstamm PA14, K.O.-Mutanten dieser Proteine generiert. Da die Außenmembran von Pa sowohl einen wichtigen Schutzfaktor darstellt, als auch eine große Rolle bei der Virulenz der Bakterien spielt, wurden Proteine ausgewählt, die an der AM-Biogenese beteiligt sind. BamC ist ein Lipoprotein und Bestandteil des BAM-Komplexes, der für Faltung und Einbau von Proteinen in die AM sorgt. Die Außenmembranproteine werden im Cytoplasma gebildet und anschließend zur AM und dem dort lokalisierten BAM-Komplex transportiert. Dazu interagiert das periplasmatische Chaperon HlpA mit den ungefalteten AMPs, transportiert sie durch das Periplasma zur AM und verhindert die Aggregation der Proteine. Bei der Faltung und Stabilisierung vieler AM- und von Pa sekretierter Proteine spielen Disulfidbrücken ebenfalls eine wichtige Rolle. Die Oxidoreduktase DsbA1 und die IM-Proteine DsbB und DsbH spielen als Enzyme bei der Bildung von Disulfidbrückenbindungen eine maßgebliche Rolle. DsbA1 katalysiert ihre Bildung, DsbB und DsbH reoxidieren DsbA1 und stellen so den Ausgangszustand und damit die Funktionalität wieder her. Die beiden Proteine sind vermutlich redundant. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit zusätzlich eine Doppel-K.O.-Mutante erstellt. Mit Hilfe der in dieser Studie hergestellten Deletionsmutanten wurde untersucht, ob die entsprechenden Gene für die Integrität der AM eine wichtige Rolle spielen. Die Charak¬teri¬sierung der Mutanten erfolgte durch Versuche mit AB, Gallensalzen und Humanserum. Dabei zeigten sich nur bei der ∆bamC-Mutante Hinweise auf eine gestörte Membranintegrität. Die Bakterien waren im Vergleich zum Wildtyp sensitiver gegenüber Vancomycin, Cefotaxim und Ampicillin in Kombination mit Sulbactam. Das Wachstum der Mutante zeigte sich auch in Anwesenheit von Gallensalzen signifikant gehemmt. Die Ergebnisse des Versuchs mit Humanserum deuteten zwar zunächst ebenfalls ein eingeschränktes Überleben der Bakterien an, bildeten allerdings nur einen einzigen Zeitpunkt ab und sind deshalb nur bedingt verwertbar. In allen Experimenten zeigten sich die Einschränkungen der Mutante im Vergleich zum WT nicht besonders stark ausgeprägt. Das lässt die Schlussfolgerung zu, dass BamC bei der AM-Biogenese von Pa eine eher untergeordnete Rolle spielt. Daher scheinen die Bakterien den Ausfall des Proteins weitgehend kompensieren zu können, sodass die AM-Integrität nur in geringem Ausmaß beeinträchtigt wird. Zusammenfassend empfiehlt sich deshalb weder BamC, noch eines der anderen untersuchten Proteine, als gutes Target für die Entwicklung von Antiinfektiva.