Die Wirkung von LEFTY 2 auf Zellmigration und Proliferation in Endometriumkarzinom

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URI: http://hdl.handle.net/10900/108672
http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-dspace-1086726
http://dx.doi.org/10.15496/publikation-50049
Dokumentart: PhDThesis
Date: 2020-10-27
Language: English
Faculty: 4 Medizinische Fakultät
Department: Medizin
Advisor: Lang, Florian (Prof. Dr. Dr.)
Day of Oral Examination: 2020-01-23
DDC Classifikation: 610 - Medicine and health
Keywords: Gebärmutterschleimhautkrebs
Other Keywords: lefty II
endometrial Cancer
License: http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_mit_pod.php?la=de http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_mit_pod.php?la=en
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Inhaltszusammenfassung:

Ungeregeltes Zellwachstum führt zur Krebserkrankung, die die Fähigkeit in Nachbargeweben einzudringen entwickelt und auf andere Organe metastasieren könnte. Das Endometriumkarzinom ist ein Epithelialkrebs, der aus dem Endometrium ausgeht, zum Myometrium der Gebärmutter oder / und dem zervikalen Stroma eindringen könnte. Jährlich wird bei 320000 Frauen weltweit das Endometriumkarzinom diagnostiziert und 76000 Frauen sterben daran. Eine therapeutische Intervention wird deshalb dringend benötigt. LEFTY2, auch Endometriumblutungen-assoziierter Faktor (EBAF) genannt, ist ein Mitglied der Transforming Growth Factor (TGF) -β Familie. LEFTY2 ist im gesunden Endometrium in geringer Konzentration vorhanden, aber das Expressionsniveau wird vor und während der Regelblutung erhöht. LEFTY2 Überexpression steht nicht nur im Zusammenhang mit Unfruchtbarkeit, sondern auch mit einer dysfunktionalen uterinen Blutung (DUB). LEFTY2 reguliert den Stammzellenphänotyp und die embryonale Differenzierung und kann Zellproliferation und Migration hemmen. Zellproliferation und Motilität benötigen Aktinreorganisation, die unter der Kontrolle des ras-verwandten C3 Botulinumtoxin-Substrats 1 (Rac1) und p21- Protein-activated kinase 1 (PAK1) stehen. LEFTY2 hemmt die Aktivität des Na + / H + Austauscher NHE1 und führt in Ishikawa-Zellen zu einer Verringerung des cytosolischen pH. NHE 1 Aktivität wird von Rac1 kontroliert. NHE1 trägt außerdem zur Stabilisierung und Lokalisierung von filamentösem Aktin (F-aktin) bei, das ein ZytoskelettStruktur-Protein ist und eine entscheidende Rolle beim Aufrechterhalten der zellulären Form spielt. Die vorliegende Arbeit untersucht, ob LEFTY2 das Aktin-Zytoskelett, die Form und die Steifheit von Ishikawa-Zellen (eine gut differenzierte Endometriumkarzinom-Zelllinie) modulieren kann. Die Wirkung von LEFTY2 auf das globuläre/filamentäre Aktin-Verhältnis wurde unter der Verwendung von 86 Western-Blot und Durchflusszytometrie bestimmt. Wir zeigten, dass LEFTY2 einen hemmenden Effekt auf die Aktin-Polymerisation hat. Rac1 und PAK1 Transkriptlevel wurden mittels qRT-PCR und phospho Rac1 und PAK1 wurden mittels Immunoblotting gemessen. Nach 2 Stunden Behandlung mit LEFTY2 (25 ng / ml) folgte eine signifikante Verringerung des Rac1 und PAK1 Transkriptniveaus und Aktivität, und eine Depolymerisierung des Aktin. Ferner wurde der Effekt von LEFTY2 auf die Aktin-Polymerisation durch pharmakologische Hemmung von Rac1 und PAK1 nachgeahmt. LEFTY2 zusammen mit Rac1 oder PAK1 Inhibitor führten zu keiner signifikanten weiteren Aktin-Depolymerisation. Maligne Transformation kann durch den Verlust von Zell-Zell-Adhäsion sowie durch Erwerb der Migrationseigenschaften zur Migration führen. Die Signaltransduktion inklusive von focal adhesion kinase (FAK) und Adhäsionsmoleküle E-Cadherin waren in der Migration, Proliferation und Verbreitung von Krebszellen involviert. Wir untersuchten als nächstes, ob LEFTY2 die Proliferationsmarker MKi67, FAK-Aktivität, E-Cadherin Menge und die Migration von Ishikawa-Zellen beeinflusst. Darüber hinaus untersucht die Arbeit die Beteiligung von microRNA-200a (miR200a), die durch gezielte Beeinflußung von E-Cadherin, die Zelladhäsion reguliert. Zu diesem Zweck wurde FAK-Aktivität mittels FAK-Phosphorylierung durch Western blotting, Migration durch Verwendung eines Wundheilungs Assay, miR-200a und MKi67 Expressionsniveaus unter Verwendung von qRTPCR, Zellproliferation und Apoptose unter Verwendung von BrdU und Annexin V-Färbung bzw. und E-Cadherin (E-CAD) Menge, mit der konfokalen Mikroskopie untersucht. Als Ergebnis führte LEFTY2 (25 ng / ml, 48 Stunden) Behandlung zur Abnahme der MKi67 Expression, FAK-Aktivität sowie Migration. LEFTY2 steigert miRNA-200a und E-Cadherin levels in IshikawaZellen hoch. Die Wirkung von LEFTY2 auf Migration wurde mittels FAKInhibitors (PF 573228) (50 µ M) bestätigt. Die Zugabe von LEFTY2 in 87 Gegenwart von PF-573228 führte nicht zu einem weiteren deutlichen Rückgang der Migration. Abschließend beschreibt diese Arbeit die neue Funktion von LEFTY2 bei der Herunterregulierung der Aktivität von Rac1 und Pak1, mit daraus resultierender Aktin Depolymerisation, Zell Steifigkeit und Zellschrumpfung. Darüberhinaus vermindert LEFTY2 die MKi67 Expression und die FAK-Aktivität, erhöht miR200a und E-Cadherin und zusammengefasst ist somit ein negativer Regulator der endometrialen Proliferation und Migration.

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