Epigenetische Modulation der Tumor-spezifischen Antigen-Expression in Kombination mit Immun-Checkpoint-Inhibitoren für den adoptiven T-Zelltransfer in pädiatrischen Sarkompatienten

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URI: http://hdl.handle.net/10900/107005
http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-dspace-1070058
http://dx.doi.org/10.15496/publikation-48383
Dokumentart: Dissertation
Date: 2020-09-22
Language: German
Faculty: 4 Medizinische Fakultät
Department: Medizin
Advisor: Handgretinger, Rupert (Prof. Dr.)
Day of Oral Examination: 2020-09-07
DDC Classifikation: 610 - Medicine and health
Keywords: Osteosarkom , Kind , Jugend
Other Keywords: MAGE-A3
PRAME
ROR1
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Inhaltszusammenfassung:

Osteosarkome sind die häufigsten und Ewing Sarkome die zweithäufigsten soliden Tumore bei Kindern und Jugendlichen. Die Prognose von Erkrankten ist, vor allem wenn das Sarkom zum Zeitpunkt der Diagnose bereits metastasiert ist oder ein Rezidiv auftritt, seit circa 20 Jahren gleichbleibend infaust mit einem 5-Jahres-Überleben von etwa 20 Prozent. Aus diesem Grund sind neue Therapien bzw. Therapieansätze nötig. Eine Möglichkeit ist ein adoptiver T-Zelltransfer von Tumorantigen-spezifischen CD4+ T-Zellen in Kombination mit dem epigenetisch wirksamen, demethylierenden Agens Decitabine und Immun-Checkpoint-Inhibitoren. Ziel der Arbeit war es, die Expression der Cancer-Testis-Antigene MAGE-A1, MAGE-A3, NY-ESO-1 und PRAME, sowie deren Änderung der Expression nach einer fünftägigen Behandlung mit der epigenetischen Reagenz Decitabine, einem DNA-Methytransferaseinhibitor, mittels quantitativer real-time PCR zu ermitteln. Für die Ewing Sarkomzelllinien konnte durch die Decitabine-Therapie eine vorwiegend sehr starke Hochregulation der Expression der vier Cancer-Testis-Antigene nachgewiesen werden. Eine Ausnahme bildete die Zelllinie RDES, hier kam es durch den Einsatz von Decitabine sogar zu einer de novo Expression des Cancer-Testis-Antigens NY-ESO-1. Bei den Osteosarkomzelllinien konnte durch Decitabine nur teilweise eine relevante Hochregulation der CTA-Expression verzeichnet werden. Eine sehr starke Hochregulation war bei den Osteosarkomzelllinien für das CTA NY-ESO-1 ermittelt worden. Zusätzlich wurden, neben den Ewing und Osteosarkomzelllinien, noch Rhabdomyosarkom- und Melanomzelllinien durchflusszytometrisch auf die Expression des Transmembranproteins B7-H3 und des Tyrosinkinase-Transmembranrezeptor ROR1 untersucht. Nahezu alle analysierten Zelllinien exprimierten B7-H3 und ROR1 stark (B7-H3: MW 73,10 % ± 29,10; ROR1: MW 59,42 ± 29,51). Ein weiteres Ziel war es Tumorantigen-spezifische IFN-γ+ CD4+ T-Zellen von gesunden Spendern mittels magnetischer Anreicherung (IFN-γ Capture Technik) für die Cancer-Testis-Antigene MAGE-A3 und PRAME (3x) sowie das Tumorantigen ROR1 zu isolieren und anschließend zu expandieren. Hierfür wurden im ersten Schritt gesunde Spender auf das Vorliegen von Tumorantigen-spezifischen IFN-γ+ CD4+ T-Zellen mittels einer in vitro T-Zellstimulation mit überlappenden Peptidmixen und einem anschließenden FACS-Immunmonitoring untersucht. Nach der Identifizierung der möglichen Spender konnte mit der eigentlichen Herstellung der T-Zellen begonnen werden. Hierbei konnten sehr hohe Zellzahlen erreicht werden, obwohl nicht alle Zellen nach der magnetischen Anreicherung verarbeitet werden konnten (MW 5,24*109 Zellen ± 5,80*109; einen positiven Ausreißer stellte PRAME (2) mit 16,65*109 Zellen dar). Die hergestellten Zellen wiesen mit einem Mittelwert von 96,06 % (± 2,15) eine sehr gute Vitalität auf. Zudem waren, bis auf bei den PRAME (3) Zellen, hohe Mengen an IFN-γ+ CD4+ T-Zellen expandiert worden (MW 71,30 % ± 18,26) und fast alle der IFN-γ+ CD4+ T-Zellen waren zu T-Gedächtniszellen des Effektortyps ausdifferenziert (95,14 % ± 3,34). Des Weiteren lag bei den generierten IFN-γ+ CD4+ T-Zellen ein TH1-Phänotyp vor (Sekretion der Zytokine IFN-γ, TNF-α und IL-2), wobei TNF-α vor IFN-γ das führende Zytokin darstellte. Darüber hinaus zeigten die generierten Tumorantigen-spezifischen IFN-γ+ CD4+ T-Zellen im CD107a und im CFSE-Assay alle ein zytotoxisches Potential und die Fähigkeit zu proliferieren, wenn auch in unterschiedlich hohem Maße. Die Expression der Immun-Checkpoints nahm bei fast allen Tumorantigen-spezifischen CD4+ T-Zellen im CFSE-Assay, verglichen mit dem CD107a-Assay, stark zu. Der Einsatz von Immun-Checkpoint-Inhibitoren führte zu einer Steigerung der Proliferation, wobei der Effekt annähernd verschwand, wenn man die Proliferation in Abhängigkeit zur entsprechenden Negativkontrolle betrachtete, da diese ebenfalls eine gesteigerte Proliferation aufwies. Das zytotoxische Potential konnte, mit der Ausnahme der MAGE-A3 spezifischen CD4+ T-Zellen, durch die Verwendung von Immun-Checkpoint-Inhibitoren ebenfalls gesteigert werden. Nachdem die vorherigen Experimente abgearbeitet worden waren, konnte das nächste Ziel, die Wirkung der generierten T-Zellen auf die Tumorzellen, mittels BrdU-Assay, in Angriff genommen werden. Hierfür wurde die Melanomzelllinie WM115 ausgewählt, da bei dieser über die Zytokine IFN-γ und TNF-α Seneszenz induziert werden kann. Die Überstände der generierten Tumorantigen-spezifischen IFN-γ+ CD4+ T-Zellen waren in der Lage bei der Melanomzelllinie WM115 einen Wachstumsstillstand, vorwiegend in der G0/G1-Phase des Zellzyklus, und eine reduzierte S-Phase zu induzieren. Ein zweimaliger Versuch über neun Tage, ob die Zellen nach Entfernung der Zytokine wieder proliferieren, schlug fehl, so dass von einem vorübergehenden Wachstumsstillstand ausgegangen werden kann. Im Gegensatz dazu konnte durch den Einsatz der Zytokine IFN-γ und TNF-α kein messbarer Einfluss auf die Proliferation der Tumorzellen des Ewing Sarkoms RDES festgestellt werden. Die Kombination des adoptiven T-Zelltransfers von generierten spezifischen CD4+ T-Zellen mit einer epigenetischen Modulation und dem Einsatz von Immun-Checkpoint-Inhibitoren scheint ein Erfolg versprechender Ansatz für die Behandlung von Krebserkrankungen zu sein. Jedoch muss noch weitere Forschungsarbeit betrieben werden, bis die konkreten Abläufe, sowie die Effekte der Immun-Checkpoint-Inhibitoren auf die generierten T-Zellen im Detail verstanden sind.

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